微环DNA表达抗EpCAM/抗CD3双特异BiTE分子的抗卵巢癌细胞体外实验研究

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1.1 主要仪器及试剂

化学发光成像系统（Bio-red，美国）;倒置生物显微镜（OLYMPUS，日本）;Bright-GloTM萤光素酶检测系统（Promega，E2610）;分选型流失细胞仪（BD Cano Ⅱ）;动态光散射粒径测试仪（Malvern，英国）;荧光倒置显微镜（Nikon，日本）;Anti-6*His tag antibody（Abcam，美国）;蛋白显影液（Cell Signaling，美国）;PVDF膜（Millipore，美国），anti-rabbit IgG（Cell Signaling，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb的制备  采用X-treme-GENE HP DNA transfection reagent和表达载体SZ-90 EpCAMxCD3瞬时转染HEK293细胞，使用Expi293表达培养基获得大量含有表达产物的细胞培养上清。收集上清液进行蛋白的检测。

1.2.2 抗EpCAM/抗CD3 BsAb的纯化  用cOmplete His-Tag Resin和？魧KTA蛋白纯化系统分离纯化BsAb抗体。采用Werstern blot技术。将抗EpCAM/抗CD3 BsAb表达上清液和HEK293细胞裂解液，加入5×蛋白loading buffer混合。转膜，切取蛋白Marker在14～97 kD的位置，将其覆盖在PVDF膜的负极方向，将混合液滴加到膜上并进行曝光成像。

1.2.3 流式细胞术检测BiTE对T细胞和EpCAM+肿瘤细胞的选择性结合，抗EpCAM/抗CD3 BsAb靶向性检测  抗体分别和（A）T细胞、（B）CaOV3-luc细胞孵育，后加入APC-conjugated anti-His抗体作为二抗，流式细胞术检测荧光强度。

1.2.4 抗EpCAM/抗CD3 BsAb介导T细胞对人卵巢癌CaOV3的细胞毒性作用  本实验分4组进行观察：T细胞组、卵巢癌细胞组、T细胞加卵巢癌细胞组以及抗体加T细胞加卵巢癌细胞组。T细胞、SKOV3细胞和抗体孵育。分别用碘化丙啶（PI）和Calcein-AM复染，将PI+ Calcein-AM培养，分别在光镜以及倒置荧光显光显微镜觀察，并采用电脑合成图像把PI和Calcein-AM染色图像融合于一图中观察。

1.2.5抗EpCAM/抗CD3 BsAb介导T细胞杀伤卵巢癌CaOV3细胞  效靶比为10∶1，T细胞、CaOV3-luc细胞和抗体共孵育6 h和12 h，培养基：98McCoy 5a +1FBS+1青/链霉素双抗，ONE-GloTM萤光素酶检测系统试剂盒检测抗EpCAM/抗CD3 BsAb介导的T细胞毒性作用。Promega GloMax 96微孔板发光检测仪设置：读取数据。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb体外表达

采用蛋白电泳分离细胞上清液中抗体，见抗体外表达成功，分子量约为59 kD，无其他杂带出现。见图1。

Lane A：细胞上清;Lane B：流穿液;Lane C：20 mmol/L 咪唑洗脱液;Lane D：50 mmol/L咪唑洗脱液;Lane E：200 mmol/L咪唑洗脱液;Lane F：500 mmol/L咪唑洗脱液

2.2 抗EpCAM/抗CD3 BsAb体外表达提纯

使用蛋白质免疫印迹技术顺利提纯抗体。见图2。

2.3 流式细胞仪检测抗EpCAM/抗CD3 BsAb可分别靶向结合T细胞及卵巢癌细胞

2.3.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb靶向结合T细胞检测结果  单一T细胞的平均荧光强度（MFI）：1587。抗体加T细胞后的MFI：24 625。由图可见未结合抗体的T细胞与结合抗体T细胞在流式细胞仪下明显区分，提示抗体能够靶向结合T细胞。见图3。

2.3.1 抗EpCAM/抗CD3 BsAb靶向结合卵巢癌细胞检测结果  单一卵巢癌细胞的MFI：1809。抗体加卵巢癌细胞后的MFI：84526。由图可见未结合抗体的卵巢癌细胞与结合抗体卵巢癌细胞在流式细胞仪下明显区分，提示抗体能够靶向结合卵巢癌细胞。见图4。

2.4 抗体介导T细胞对人卵巢癌的细胞毒性作用的形态学变化

2.4.1 光镜和Calcein-AM染色图  见T cells + CaOV3肿瘤细胞均散在分布，少许T细胞围绕肿瘤细胞。T cells +SKOV-3+抗体图：T细胞和肿瘤细胞聚集成块的卵巢癌肿瘤-T细胞团，散在T细胞较少。见图5。

2.4.2 PI染色图  卵巢癌细胞和T细胞组：少量卵巢癌细胞及少量T细胞被PI染色，说明卵巢癌细胞和T细胞中有少量死细胞。T cells + CaOV3组见死亡细胞增多并聚集。T cells +SKOV-3+抗体组：T细胞和卵巢癌细胞大量聚集，并成块的卵巢癌肿瘤-T细胞团，死亡细胞明显增加。见图5。

2.4.3 融合图  增加抗体后的卵巢癌细胞死亡细胞数较明显增多，并聚集成团。见图5。

2.5 抗体对于诱导T细胞杀伤卵巢癌细胞的细胞特异性杀伤率随时间以及浓度的变化情况

抗体对于诱导T细胞杀伤卵巢癌细胞的细胞特异性杀伤率随时间的延长效果不是一直增强。抗体的浓度低于1×10-6 μg/mL时，6 h的特异性杀伤率与12 h比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;而浓度升高时，12 h的效果较6 h更强，随着剂量的增加而杀伤效果更好，直到浓度到达1×10-3 μg/mL，出现效果下降。抗体的浓度≥1×10-5 μg/mL时，两个时间的特异杀伤率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。两个不同时间的特异杀伤率均在1×10-4 μg/mL的浓度时，杀伤效率最强。见表1。

3 讨论

卵巢癌是妇科死亡率第一[11]的恶性肿瘤。耐药及杀伤自身健康细胞是造成其高死亡率的重要原因之一[12]。近年来，癌症的免疫治疗在血液系统等恶性肿瘤治疗中取得卓越的成就[13-14]，免疫治疗的巨大优越性让其在肿瘤化疗治疗中成为研究的热点[15-16]。传统的抗体基因疗法中抗体半衰期短，技术要求高精阻碍免疫治疗的推广。本研究采用的非病毒载体的微环DNA可以在同等条件下实现持续表达。微环DNA能在体内长期、稳定、高效地表达目的基因且几乎无毒性。目前本实验所使用的微环DNA的制备技术在已实现安全、无毒、高质量的规模化制备[17]并取得中国专利201510859263.2。

EpCAM在卵巢癌细胞中高表达并可促进卵巢癌细胞生长，种植，转移等[7]，本实验BiTE的两种抗体[18]，一靶向肿瘤细胞EpCAM，另一靶向T细胞表面分子CD3，桥接卵巢癌细胞和T细胞，介导特异性杀伤。本实验可清晰看到非病毒载体MC系统成功表达抗EpCAM/抗CD3 BsAb。

研究表明肿瘤细胞的免疫杀伤主要是通过双特异抗体在肿瘤细胞和T细胞之前形成“免疫突触”[19-20]，起到抗肿瘤的免疫反应。本实验通过PI和Calcein-AM双染色，倒置显微镜下见T细胞+卵巢癌+抗体组中T细胞向卵巢癌细胞的集结增加，并出现大量细胞死亡。侧面上证明抗体能够增强诱导T细胞靶向杀伤卵巢癌细胞。

观察升高浓度和延长时间下，抗体对于诱导T细胞的特异杀伤率并不是无限增强。在同样6 h的作用下抗体浓度高于1×10-7 μg/mL后，随着浓度的上升，特异杀伤率升高，差异有统计学意义（P < 0.05），但这样的趋势并不是无限的延伸;在浓度1×10-3 μg/mL后，才出现特异杀伤效果下降。在浓度达1×10-6 μg/mL之前，6 h的特异杀伤率较高;浓度达1×10-6 μg/mL后12 h的杀伤较6 h的杀伤率高。浓度在1×10-4 μg/mL時，两时间均达到最大的杀伤。也可以理解，在使用抗体浓度方面需要，1×10-5 μg/mL～1×10-4 μg/mL持续时间12 h时，抗体诱导T细胞杀伤卵巢癌细胞最强。由此推断，抗EpCAM/抗CD3 BsAb诱导T细胞特异性杀伤卵巢癌细胞具有一定的时间以及药物浓度的依赖性，大剂量药物浓度并不会提高其对卵巢癌细胞的杀伤性，而过于密集的使用亦不能提高其杀伤性，而是在一定的浓度以及时间时间间隔里使用方可提高此抗体诱导T细胞特异杀伤卵巢癌。此实验亦为未来动物以及人体实验提供一个浓度以及时间节点。

综上所述，本实验进一步证明anti-EpCAM/CD3双特异抗体具有介导T细胞靶向、高效清除卵巢癌细胞;本实验所使用的非病毒载体的方法，基于微环DNA载体表达双特异抗体的抗癌策略的具有可行性，为卵巢癌的免疫治疗提供一种可选的基因药物。本实验同时提出，抗EpCAM/抗CD3 BsAb诱导T细胞杀伤具有一定的时间以及剂量的依赖性，为未来临床试验提供一可行的时间以及剂量数据。

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（收稿日期：2019-04-29  本文編辑：任   念）

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