【摘要】 目的 探讨孕激素介导uPA治疗卵巢癌的可能机制。方法 传代培养人卵巢癌细胞HO-8910， 应用Western blot方法检测对照组（未加孕激素组）和加入含有不同浓度孕激素培养液处理组， 作用72 h后对人卵巢癌细胞HO-8910 uPA表达的影响。结果 Western blot实验结果表明孕激素能够抑制uPA的表达， 呈浓度依赖性。结论 孕激素对卵巢癌细胞有抑制作用并且抑制人卵巢癌细胞uPA的表达， 提示孕激素用于卵巢癌的辅助治疗可能介导对uPA的影响起作用。
【关键词】 尿激酶型纤溶蛋白酶原激活剂；卵巢癌；孕激素；蛋白印记法
尿激酶型纤溶蛋白酶原激活系统（uPA系统）主要包括尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、uPA特异性受体（uPAR）和纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）。uPA能激活无活性纤维蛋白溶解酶原生成纤溶酶， 使纤维蛋白水解成可溶性肽类片段。纤维蛋白溶解参与肿瘤生长和肿瘤细胞的浸入过程， uPA调节细胞外基质蛋白的降解， 并能激活刺激肿瘤生长因子和其他蛋白酶[1]。肿瘤自身分泌的uPA可激活纤溶酶原为纤溶酶， 使基底膜裂开， 有利于肿瘤的侵袭和转移[2]。
有学者认为：孕激素抑制癌细胞是孕激素作用于癌细胞并与孕激素受体结合形成复合物进入细胞核， 延缓DNA和RNA复制， 抑制癌细胞生长[3]。但其确切机制， 仍不清楚。对于uPA在卵巢癌中的抗原表达及含量国外已有报道， 关于孕激素应用于卵巢癌的辅助治疗也有报道。但关于孕激素对卵巢癌细胞中uPA表达的影响目前尚无报道。本研究旨在应用 Western-blot法研究孕激素对人卵巢癌细胞中uPA表达的影响， 从而探讨孕激素在卵巢癌辅助治疗中的可能机制， 为临床治疗卵巢癌提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 细胞来源 卵巢浆液性囊腺癌细胞HO-8910（上海中科院细胞库）细胞形态及生物学特征均符合卵巢浆液性囊腺癌特征。
1. 1. 2 实验试剂
RPMI-1640培养液（大连晨玉）
胰酶 （大连晨玉）
Hepes（大连晨玉）
标准胎牛血清（大连博瑞德）
MTT（大连博瑞德）
uPA兔抗人多克隆抗体（北京博士德）
SP免疫试剂盒（北京中杉）
二甲基亚砜（大连诚锐）
蛋白印记试剂如：NC、丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、氯化钠、甲醇、冰乙酸、脱脂奶粉等（大连博瑞德）
耗材（沈联化学试剂玻璃仪器有限公司）
1. 1. 3 主要设备
相差倒置显微镜（olympus公司）
CO2孵箱（Forma公司）
常温台式离心机（Sigma公司）
超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）
三用水箱（北京医疗设备厂）
多用途水浴恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂）
电泳仪（大连捷迈生物公司）
转膜仪（大连捷迈生物公司）
1. 2 实验方法
1. 2. 1 细胞培养 ①试剂配置：RPMI-1640细胞培养基：用于培养卵巢癌细胞HO-8910。每升培养液中含RPMI 1640粉剂10.4 g、HEPES 4.8 g、NaHCO3 2.0 g、经灭活的胎牛血清（FCS）100 ml、青霉素及链霉素各100 U/ml， 调节pH=7.4， 抽滤灭菌， 分装， 4 ℃保存。PBS （10×）：称取NaCl 8.5 g， Kcl 0.2 g， Na2HPO4·12H2O 2.85 g， KH2PO4 0.24 g， ddH2O 100 ml， 调pH=7.4， 高压灭菌， 保存于4℃。②细胞培养：人卵巢癌细胞HO-8910常规培养于含10%胎牛血清、双抗的RPMI-1640完全培养基中。置37℃、5%CO2培养箱内培养， 相对湿度90%， 培养至70%～80%融合时， 0.25%胰蛋白酶消化、传代。当细胞达到一定数量后， 细胞记数， 将一定数量细胞分别培养在4个大培养瓶中， 第2天待细胞贴壁后置入4℃恒温箱1 h， 促成细胞同步化生长， 然后加入等量的含不同浓度孕激素的培养液， 继续培养72 h。作用72 h后将4个培养瓶中的细胞消化下来离心收集， 保存在-70℃冰箱中备用。
1. 2. 2 MTT比色法 取对数生长期的人卵巢癌细胞HO-8910， 5×10-3/孔细胞数接种于96孔板， 置37℃、5%CO2培养箱内培养， 第2天大部分贴壁后置入4℃恒温箱1 h， 促成细胞同步化生长， 弃上清， 然后加入含有从1×10-4 mol/L倍比稀释至0.03125×10-4 mol/L（由于孕激素是用酒精溶解为避免酒精对卵巢癌细胞有抑制作用故选取的酒精浓度<1%）孕激素的等量培养液中， 并设阴性对照（不加孕激素组）、空白对照（不加细胞组）及1%酒精组， 共8组， 每组设4个副孔， 培养48 h、72 h后， 各孔加入20 μlMTT溶液（浓度5 g/l）， 轻轻震荡培养板， 继续孵育4 h， 轻轻吸弃孔内培养上清液， 每孔加入DMSO溶液150 μl， 轻轻震荡15 min， 测A-580值。重复3次。筛选出合适的作用时间和孕激素浓度进行Western blot实验。
1. 2. 3 Western blot法 ①提蛋白：收集用含有终浓度为0.5×10-5、1×10-5、0.5×10-4 mol/L孕激素培养液处理72 h后的人卵巢癌细胞HO-8910， 离心2500 rmp， 10 min；弃上清， 用2 mlPBS吹吸洗涤细胞沉淀， 离心2500 rpm， 10 min；弃去上清， 用1 mlPBS吹吸洗涤细胞沉淀， 转入1.5 mlEP管， 弃净上清， 加入细胞裂解液， 超声震荡器震荡， 4℃离心3000 rpm， 5 min， 提取上清， 取上清保存-20℃。②测蛋白：用754法测定蛋白含量， 计算上样量。③配胶：将配制好的12%SDS-PAGE分离胶溶液5 ml混匀后立即将其注入边条厚度为1.5 mm凝胶玻璃板内， 至梳齿下约1 cm， 表面加100 μl无水乙醇封住15 min后胶凝固将无水乙醇倒掉， 用蒸馏水清洗， 滤纸吸干。见表1。配制5%浓缩胶3 ml将其灌满， 立即倾斜插入梳子， 凝固1 h， 用蒸馏水冲洗， 加入TBE。见表2。④上样：每孔上样量为30 μl， 将蛋白质样品与样品缓冲液在小EP管中混匀， 100℃加热3 min， 离心1 s， 用微量注射器将样品加入样品孔中， 进行电泳。其中一孔加入蛋白质分子量Marker。⑤电泳：插好电极， 当染料的前沿迁移至凝胶的底部约需2 h。电泳结束后， 关闭电源， 从电极上拔掉电极插头， 将凝胶玻璃板从电泳槽中取出， 小心移动两玻璃板之间的隔片， 轻轻撬开玻板， 使凝胶贴在其中的一块板上。⑥转膜及染色：电泳后将凝胶浸入转移缓冲液1 h， 滤纸和硝酸纤维素膜剪成与凝胶同样大小， 于转移缓冲液中浸泡30 min， 按顺序将硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸放好， 用玻璃棒将各层之间的空气赶走进行转膜1 h， 转移后将硝酸纤维素膜和凝胶丽春红染色， 观察条带。⑦封闭及杂交 硝酸纤维素膜TBS漂洗、加脱脂奶粉封阻过夜、加一抗37℃1 h、TBS漂洗3次、加二抗37℃1 h、TBS漂洗3次、加酶标37℃1 h、TBS漂洗3次。⑧显色：取DAB显色试剂， 在暗室内与硝酸纤维素膜摇动孵育1 min， 显色， 数码照相。经凝胶成像系统分析。
表1 12%的分离胶
试剂名称单面双面
ddH2O2.64 ml4.9 ml
30%丙烯酰胺3.2 ml6.0 ml
1.5 mTris-cl（PH8.8）2 ml3.8 ml
10%SDS80 μl150 μl
10%APS80 μl150 μl
TEMED5 μl8 μl
合 计8 ml15 ml
表2 5%浓缩胶
试剂名称单面双面
ddH2O2.1 ml4.2 ml
30%单/双丙烯酰胺500 μl1.0 ml
1 mTris-cl（PH6.8）380 μl760 μl
10%SDS30 μl60 μl
10%APS30 μl60 μl
TEMED4 μl8 μl
合 计3 ml6 ml
2 结果
正常对照组和孕激素处理组卵巢癌细胞HO-8910中uPA的表达量， 见图1。
实验结果， 孕激素能够抑制卵巢癌细胞HO-8910 uPA的表达， 并且呈浓度依赖性。
经凝胶成像系统分析结果如图2。
图2 经凝胶成像系统分析
3 讨论
卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一， 死亡率很高。手术与化疗是治疗卵巢癌的主要手段， 激素疗法仅用于卵巢癌的辅助治疗或对化疗耐药病例的姑息性治疗。由于激素疗法的副反应小， 毒性低， 且有一定的疗效， 因而越来越受到临床的关注[4]。
本实验应用MTT比色法发现孕激素对人卵巢癌细胞HO-8910有抑制作用， 作用72 h后对人卵巢癌细胞HO-8910有明显的抑制作用。近年来许多研究提示孕激素可降低卵巢癌的危险性， 卵巢癌血清孕激素水平高者， 生存率提高[5]。陈晓军等[6]以已行瘤体减灭术的卵巢癌患者1～4期为研究对象， 分为单纯化疗组、己酸孕酮组和普维拉组。随访、统计各组各期患者的生存率及复发率、血清激素水平、骨密度变化及化疗反应， 结果显示孕激素联合以铂类为主的常规化疗可以改善晚期卵巢癌的预后， 并且不增加化疗的毒副作用， 可改善患者的骨量丢失。通过MTT比色法筛选出对卵巢癌细胞的抑制作用较明显的合适浓度进行Western blot实验， 检测孕激素对uPA的影响， 结果发现， 孕激素的浓度越大， uPA的表达越弱， 通过条带分析发现含量也越少， 说明孕激素能够抑制uPA的表达。但孕激素做为卵巢癌治疗的辅助药物， 其作用机制不很清楚。检测孕激素对uPA表达的抑制， 也许正是孕激素抑制卵巢癌细胞生长的一条重要途径， 可能是孕激素介导对uPA的表达而发挥治疗作用。由于本实验选取的人卵巢癌细胞为浆液性囊腺癌细胞， 存在局限性， 不能说明对所有卵巢癌病理分型都有作用， 还有待于进一步的研究。并且在基因水平上还需要进一步研究， 探讨孕激素对uPA mRNA的影响及其可能机制。用激素替代治疗为卵巢癌患者提供了新的非手术的辅助治疗方法， 但是关于激素治疗卵巢癌对人体是否会产生副作用目前还存在很大争议， 有必要进行临床跟踪随访。以uPA为靶点开发出更多治疗卵巢癌的导向药物， 将成为新的研究热点。
孕激素对卵巢癌细胞有抑制作用并且抑制人卵巢癌细胞uPA的表达， 提示孕激素用于卵巢癌的辅助治疗可能介导对uPA的影响起作用。本实验选取的人卵巢癌细胞为浆液性囊腺癌细胞， 存在局限性， 不能说明对所有卵巢癌病理分型都有作用， 还有待于进一步的研究。并且在基因水平上还需要进一步研究， 探讨孕激素对uPA mRNA的影响及其可能机制。用激素替代治疗为卵巢癌患者提供了新的非手术的辅助治疗方法， 但是关于激素治疗卵巢癌对人体是否会产生副作用目前还存在很大争议， 有必要进行临床跟踪随访。
参考文献
[1]Baker MS， Bleakey P， Woodrow GC， et al.Jnhibitor PAI and subsequent effects on extracellular matrix degradation.Cancer Res， 1990， 50（10）：4676-4684.
[2]Herszyi L， Farinati F， PLebani M， et al.The role of cathepsins and the plasminogen actionary inhibitior systemin colorectal cancer.Orv Hetil， 1999， 140（33）：1833-1836.
[3]Akhmedkhanov A， Zeleniuch - Jacquotte A， Toniolo P. Role ofexogenous and endogenous hormones in endometrial cancer： reviewof the evidence and research perspectives. Ann NY Acad Sci ， 2001， 43（12）： 296-302.
[4]岳天孚， 张士伟.卵巢癌的内分泌治疗.中国实用妇科与产科， 1996， 6（12）：328-329.
[5]Bu SZ， Yin DL， Ren XH， et al.Progesterone induces apoptosis and upregalation of p53 expression in huruan ovarian carcinoma cell lines.Cancer， 1997， 79（10）：1944.
[6]陈晓军， 丰有吉.孕激素联合化疗治疗卵巢上皮性癌.复旦学报（医学版）， 2003， 30（3）：273-276.
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