摘要[目的]研究低能N+离子注入对酿酒酵母乙醇发酵活性的影响。[方法]选取S.cerevisiae AS 2.399作为受体菌，经过不同剂量的低能N+离子注入后，确定最佳的注入参数，并研究离子注入对S.cerevisiae AS 2.399乙醇发酵效率以及对乙醇发酵关键酶表达的影响。[结果]酿酒酵母AS 2.399在N+注入剂量为10×1015 ions/cm2条件下的存活率约为25%，传代培养后菌株发酵乙醇的产率约为0.42 g/g（达到理论产率的84%），相比于原始菌株有微弱提升，而与乙醇发酵相关的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶酶活值分别达到0.53和247 μmol/ml·min，大于原始菌株的相应酶活。[结论]该研究结果可为采用低能离子注入技术对酿酒酵母改良，以拓宽其利用底物的广度和提高发酵乙醇的效率奠定基础。
关键词低能N+离子；酿酒酵母；乙醇发酵；丙酮酸脱羧酶；乙醇脱氢酶酶
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）18-05760-03
在环境和能源危机背景下，生物乙醇作为一种清洁能源受到了越来越多的关注。乙醇的生产主要由微生物发酵完成，并且发酵底物通常是淀粉质、糖质和纤维素的水解产物——葡萄糖。在实际生活中，半纤维素物质的水解产物——木糖、纤维素物质的热解产物——内醚糖等糖类都较易获得，但一般产乙醇微生物却不能直接利用其作为底物。因此，通过DNA重组构建工程菌来实现不同底物的发酵具有重大意义。
低能离子束注入介导转基因技术是起源于中国的一种转基因技术，起初被用于农作物的改良[1-3]，随后又成功地用于酵母、细菌和植物三界之间的基因重组[4-5]，利用此技术构建工程菌的研究已比较成熟。微生物体内乙醇代谢的调控通常是由多个基因共同控制的，目的基因和某些潜在基因在一定程度上同等重要。相比于只涉及少量基因改造的传统DNA重组技术，低能离子注入技术可以实现大片段成簇基因的转导，除了能将目的基因导入受体菌株外，还可以导入与目的基因结构相连、功能相辅的其他基因片段，从而提高重组菌株的稳定性和生产效率。
常用来发酵乙醇的微生物包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、工程大肠杆菌（Escherichia coli）以及运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis），其中酿酒酵母是工业发酵酒精的模式菌株。笔者选取S.cerevisiae AS 2.399作为受体菌，经过不同剂量的低能N+离子注入后，确定最佳的注入参数，并研究离子注入对S.cerevisiae AS 2.399乙醇发酵效率以及对乙醇发酵关键酶表达的影响，以期为后期构建工程菌奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌种。酿酒酵母（S.cerevisiae AS 2.399），来源于中国普通微生物菌种保藏中心。
1.1.2低能离子注入机，购自西南核工业物理学院。
1.1.3主要试剂。葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、柠檬酸、柠檬酸钠、丙酮酸钠、β-NADH、NAD+、TrisHCl、无水乙醇和乙醇脱氢酶均为分析纯级，市售。
1.2方法
1.2.1YPD 培养基的制备。酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 ml。固体培养基另添加1.5%琼脂粉。
1.2.2酵母菌膜的制备及低能离子注入[5]。将酵母接入YPD 培养液中，置摇床160 r/min、30 ℃培养过夜。用灭菌的保护液（0.5%的淀粉和0.5%的葡萄糖）稀释酵母菌培养液至终浓度为1.0×107 CFU/ml，取稀释液0.1 ml，用无菌玻璃刮铲均匀涂布于直径为90 mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜。将制备的菌膜分别置于离子注入机真空靶室的无菌靶台上，在1×10-3 Pa真空状态下采用能量为15 keV，剂量分别为4×1015、5×1015、6×1015、8×1015、10×1015和11×1015 ions/cm2 的N+，以5 s脉冲注入酵母菌膜。真空条件下未注入N+的酵母菌膜作为对照。随后分别以2 ml无菌水浸泡所有菌膜，并于30 ℃培养箱中温育2 h后，用无菌玻璃刮铲反复洗脱，获得洗脱液。分别将注入剂量为4×1015、5×1015、6×1015、8×1015、10×1015和11×1015 ions/cm2的组对应标记为A、B、C、D、E、F组，对照组标记为CK，对照组及每个注入剂量对应的菌膜洗脱液分别涂布7个YPD平板，并于30 ℃倒置培养48 h，进行计数，确定最适注入参数。
1.2.3不同注入剂量的酵母发酵产乙醇。选取上一步骤酵母存活率最高的2组为试验组，设置2个对照组，对照1为真空条件下未注入N+的酵母，对照2为正常条件下的酵母。各组酵母经过平板连续传代培养后，用接种环各挑取一环接种于三角瓶中培养过夜，随后分别取1 ml作为种子液接种于100 ml培养基中进行摇瓶发酵，发酵条件为转速160 r/min、温度30 ℃，每隔4 h取样1次，直至底物葡萄糖耗尽。不同时间的乙醇产量和残糖量用高效液相色谱检测。高效液相色谱检测条件为：流动相为0.004 25 mol/L H2SO4，柱子为Transgenomic ICSep ICE-ION-300离子柱（7.8 mm×300 mm），柱温为58 ℃，流速0.4 ml/min，检测器为示差检测器。标准曲线的制作采用外标法。
1.2.4粗酶液的制备。取5 ml培养12 h的发酵液在5 000 r/min条件下离心5 min收集酵母细胞，然后用2 mmol/L的EDTA和10 mmol/L磷酸钠缓冲溶液（pH值为7.4）清洗2次，离心弃去上清液，得到干净的酵母沉淀物。随后加入玻璃珠振荡，并以液氮研磨，加入适量的2 mmol/L MgCl2和0.1 mol/L磷酸钠缓冲溶液（pH值为7.4）至研磨液总体积为5 ml，于5 000 r/min离心5 min获取的上清液即为粗酶液。
1.2.5丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）和乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）的酶活测定。对于丙酮酸脱羧酶[6]，在2.7 ml 0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液、0.1 ml 1 mol/L的丙酮酸钠溶液、0.05 ml 6.4 mmol/L的β-NADH和0.05 ml 200 U/ml的乙醇脱氢酶溶液体系中加入0.1 ml粗酶液，在温度30 ℃、波长340 nm下测定吸光度的变化来计算酶活；空白对照为2.8 ml 0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液和0.1 ml 1 mol/L的丙酮酸钠溶液体系中加入0.1 ml粗酶液。对于乙醇脱氢酶[7]，在2.6 ml 0.1 mol/L的TrisHCl缓冲液（pH=8.0）、0.2 ml 30 mmol/L的NAD+溶液和0.1 ml粗酶液溶液体系中加入0.1 ml 15 mmol/L的乙醇，同样在温度30 ℃、340 nm下测定吸光度的变化来计算酶活；空白对照为2.7 ml 0.1 mol/L的TrisHCl缓冲液、0.2 ml 30 mmol/L的NAD+溶液和0.1 ml粗酶液体系。读数从体系反应开始后的30 s开始，反应时间为3 min。定义每毫升粗酶液每分钟还原或生成NADH 的μmol数为一个酶活力单位。酶活的计算公式为：
2结果与分析
2.1离子注入对酵母的影响对所有涂布平板进行单菌落计数，计得A组菌落数为4，B组为8，C组为78，D组为24，E组为120，F组为23，CK组为480，其存活率与注入剂量之间的关系见图1。图1表明，在A组和B组低注入剂量条件下，酵母细胞的存活率较低，而随着离子注入剂量的增加，存活率先上升再下降，随后又上升下降，总体呈马鞍形曲线形式，其中在C组和E组呈现出极大值，E组存活率最高。这一现象的产生，是由于刚开始离子注入对酵母细胞产生了严重的刻蚀作用，离子损及细胞内部并产生大量自由基和软射线等，致使细胞存活率急剧下降，而后随着注入剂量的增加及离子的不断积累，细胞的某种修复机制被激活，保护酶的活性提高，使生物体产生有利于生长发育的变化，从而使得细胞存活率增加，最后更大量的离子注入对细胞产生了不可逆的损伤，又使得细胞存活率下降[8-11]。一般来说，注入剂量与其对细胞的刻蚀作用成正比，剂量越大，刻蚀通道越多、程度越强，越利于外源DNA片段的进入及融合，相应地，成功构建稳定工程菌株的概率就越高。而亲本菌体密度的大小也会影响DNA重组的成功率。因此，综合考虑注入剂量的大小及其对受体酵母的致死率，选择马鞍形曲线的极大值，即C组或E组注入剂量作为备选最适注入条件。
图1离子注入剂量与酵母细胞存活率的关系2.2离子注入对酵母发酵乙醇的影响对2个试验组和2个对照组培养基中不同时间葡萄糖的含量进行分析，结果如图2（a）所示。结果表明，所有试验组在发酵前4 h都只有微量的葡萄糖消耗，而经过离子注入的2组，在8 h时的残糖量明显高于对照组，说明其延滞期时长相比于对照组增加了，葡萄糖剩余含量的具体结果为：E组>C组>对照1>对照2。至12 h时，除了E组葡萄糖残余量较多（2.04 g/L）外，其他组都只有极少量（0.35 g/L左右）剩余。而根据底物消耗趋势分析，剩余葡萄糖在12 h后的一小段时间内即被全部消耗。
对2个试验组和2个对照组培养基中不同时间的乙醇含量进行分析，结果如图2（b）所示。所有试验组在前4 h 时都无乙醇生成，而离子注入过的2组，乙醇含量在同一阶段明显小于2个对照组。至发酵完成后，E组的乙醇产量略高于其他组，产率约为0.42 g/g。
值得一提的是，在2个对照组中，真空条件下放置过的酵母（即对照1）在8 h时糖利用率低于未经任何处理的酵母（对照2），然而其乙醇产量却高于对照2。同样地，对照1在12 h时的残糖量几乎和对照2相等，但其乙醇产率仍然高于对照2。这说明真空条件对酵母的产乙醇途径及相关代谢机制产生了影响，从而增加了酵母的发酵效率。褚江永等[12]曾报道N+注入和真空作用均能影响辣根过氧化物酶和超氧化物歧化酶的2级结构，N+注入所产生的生物学效应是注入离子和真空2个物理因素共同作用的结果，甚至有时真空作用比N+注入所起的作用还要大，这与本研究的此项结果相符。经离子注入的2组酵母，虽然其整体发酵效率受到影响，但最终乙醇产量却变化不大，这可能是注入离子的刻蚀作用削弱或抑制了与细胞初期生长代谢有关的某些功能，导致其发酵过程整体延迟。图2不同时间各组培养基中葡萄糖和乙醇含量2.3乙醇发酵关键酶的酶活测定由于离子注入影响了酵母的乙醇发酵效率，试验进一步对在乙醇发酵过程中起关键作用的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶进行了酶活性分析。由表1可知，酶活性大小具体为，丙酮酸脱羧酶酶活：对照1>E组>C组>对照2，乙醇脱氢酶酶活：对照1>E组>对照2>C组。可以看出，对照1的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的酶活性值皆为最大，E组次之，而对照2和C组的丙酮酸脱羧酶活性值相似，但对照2的乙醇脱氢酶活性值大于C组。对照1为真空条件下放置的酵母，其高酶活性值也与前面所述的高乙醇发酵效率相一致。而E组虽然也具有相当高的酶活值，但发酵结果表明其在同一时间段的耗糖率和乙醇产率并不高，这可能是由于离子注入影响了其发酵前期的某些必需物质的合成，导致细胞生长和代谢滞后。C组和E组同为离子注入过的酵母，但2种酶的活性值相差甚大，且葡萄糖利用率和乙醇生产速率也各不相同，这说明不同的离子注入剂量不仅影响细胞的存活率，而且会改变细胞分子水平上的相关机制，进而对发酵性能产生影响。相对于原始酵母菌株（对照2）来说，单独的真空作用（对照1）和真空条件下适当剂量的离子注入作用（E组）都增加了其乙醇发酵相关关键酶的活性，并在宏观上改变了酵母的乙醇发酵效率。因此，选择E组的注入条件为最适条件。
3结论
低能离子注入介导转基因技术的兴起和发展展现了其在生物学领域的巨大应用潜力。考虑离子注入对细胞的致死率、乙醇产率和酶的表达活性的影响，在试验中，S.cerevisiae 2.399的N+ 最适注入剂量为10×1015 ions/cm2，在此条件下酵母细胞的存活率约为25%，以葡萄糖为底物发酵乙醇的产率约为0.42 g/g（达到理论产率的84%），与乙醇发酵相关的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶酶活值分别约为0.53和247，这些指标相比于原始菌株都有所提高。此结论可为通过低能离子注入技术改造酿酒酵母的基因提供参考。
安徽农业科学2014年参考文献
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