材料提供参考。
关键词：啤酒花；抗病毒；双价干扰载体；遗传转化
中图分类号：S567.23+9：Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）01-0001-06
Abstract To construct RNAi vector both resistant to Hop latent virus （HpLV） and Hop latent viroid （HpLVd）， the pathogenic region of 202 bp in HpLV and the conserved sequence of 155 bp in HpLVd were selected as interference sequence through sequence alignment. The bivalent RNAi vector against HpLV and HpLVd were constructed based on interference vector pUCCRNAi， then its functional region was connected to plant expression vector pCAMBIA2300-35S-OCS through specific restriction sites. And the objective fragments were transformed into hops through Agrobacterium-mediated method. PCR identification showed that RNAi expression vector had been successfully transformed into hops. The construction of RNAi expression vector and Agrobacterium-mediated transformation in this study provided references to induce posttranscriptional gene silencing in transformed plants and obtain new multiple-virus-resistant plant materials.
Keywords Hops；Virus resistance；Bivalent interference vector；Genetic transformation
近年來随着啤酒工业的迅速发展，啤酒花种植面积不断扩大，新疆作为我国啤酒花主要生产基地，产量占全国的70%。啤酒花为多年生草本植物，生产过程中由于连作和重茬导致啤酒花病害日趋严重。啤酒花潜隐病毒（Hop latent virus， HpLV）和啤酒花潜隐类病毒（Hop latent viroid，HpLVd）是危害啤酒花的两种主要病毒。Schmidt等[1]首次发现了HpLV，该病毒属于麝香石竹病毒属（Carlavirus），病毒粒子为直形或轻度弯曲线状粒体，核酸为单链线性RNA，为单分子体病毒。Hataya等[2]2000年测定了HpLV全长基因组序列8 612 bp，包含一个poly（A）尾及6个开放阅读框（ORF）。刘升学等[3]从新疆不同的啤酒花种植区中检测到HpLV，并对其外壳蛋白基因序列以及全基因组序列进行了分析。HpLVd隶属于马铃薯纺锤形块茎类病毒科（Pospiviroidae），椰子死亡类病毒属 （Cocadviriod）[4]。啤酒花潜隐类病毒为单链环状 RNA，全长256 bp，有5个功能区[5]。两者寄主范围较窄，广泛分布在啤酒花种植区，大多数啤酒花品种感染HpLV与HpLVd后无明显症状。目前尚未见HpLV侵染啤酒花后对产量影响的报道，但HpLVd侵染后会导致啤酒花一些次生代谢产物成分发生改变，从而影响啤酒花品质，降低啤酒花产量[6]，而且啤酒花一旦感染HpLVd，就无法脱毒，只能将被感染植株连根拔起[7]，因此寻求对啤酒花病毒病的有效防治方法十分重要。
RNAi是生物体本身的一种RNA防御机制，普遍存在于植物、动物和真菌等大多数真核生物中[8]。植物体天然的RNAi系统不能完全抵御某些病毒的入侵，如果人为地将这些病毒的某一段序列设计成含反向重复的双链结构转入植物体内，使其在植物体内表达从而诱发RNAi，可有效强化植物体自身的RNAi抗病毒机制，获得较高抗性的转基因植物，达到延迟和减轻病毒病害的目的[9]。目前RNAi干扰技术已成为创制抗病毒转基因作物新种质的有效途径。本研究拟构建同时包含HpLV与HpLVd基因保守区段的双价RNAi植物表达载体，并进一步转化啤酒花，为诱发RNAi效应、培育兼抗两种以上病毒的抗病啤酒花新材料做准备。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大肠杆菌菌株Escherichia coli TOP10、RNAi载体pUCCRNAi、表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS均为石河子大学农业生物技术重点实验室保存。克隆载体pGM-T Easy、Taq DNA聚合酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA Marker购自北京Tiangen公司，限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、BglⅡ、T4 DNA ligase购自大连宝生物技术公司，其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。引物合成、测序均由上海生工生物工程公司进行。
1.2 靶标基因功能区域片段的选定及合成
根据刘升学等[3]对啤酒花潜隐病毒外壳蛋白基因的分析，找到一段长度为202 bp的高度保守的致病区序列，在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上比對后作为干扰序列（图1）。
在GenBank数据库中搜索啤酒花潜隐类病毒HpLVd序列并进行序列同源性比对，选取一段长度为155 bp的高度保守序列作为干扰序列（图2）。
由上海生工生物工程股份公司将两段序列合成至pUC57载体中，并在序列5′端加入酶切位点Xho Ⅰ，3′端加入酶切位点Bgl Ⅱ，命名为HpLV-d。
1.3 同步沉默双价RNAi载体的构建
1.3.1 正向片段的插入 将载有人工合成HpLV-d片段的pUC57载体和pUCCRNAi载体分别用XhoⅠ和BglⅡ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，pUCCRNAi回收大片段，HpLV-d回收369 bp的小片段。将回收的片段进行连接反应，反应体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μL、HpLV-d片段5 μL、pUCCRNAi载体片段1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、ddH2O 补齐至25 μL，16℃连接24 h后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。
取200 μL菌液均匀涂抹在含氨苄青霉素（ampicillin， Amp+）的固体LB培养基上， 37℃恒温暗培养箱内倒置培养10～12 h，挑取长势稳定的单斑，点入600 mL含Amp+的液体LB培养基内，37℃、500 r/min恒温摇床摇2 h后取1 μL菌液进行PCR筛选，提质粒进行酶切鉴定。利用引物F1： 5′-TAGTTGTGGTTTGTTCCTCTGGT-3′、F2： 5′-GTAAAGCTCGGCGCTCAAGA-3′进行菌液PCR检测，重组质粒用XhoⅠ和BglⅡ进行酶切鉴定，将重组质粒命名为pUCCRNAi-Z。
1.3.2 反向片段的插入 用BamHⅠ和SalⅠ双酶切pUCCRNAi-Z，将HpLV-d回收的369 bp小片段与其进行连接反应（XhoⅠ和SalⅠ、BglⅡ和BamHⅠ互为同尾酶），转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，并进行菌液PCR、质粒酶切检测，将干扰片段反向插入PUCCRNAi-Z载体中，得到的载体命名为pUCCRNAi-HpLV-d。
1.4 植物表达载体的构建
用Pst Ⅰ单酶切已构建的pUCCRNAi-HpLV-d载体和pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体，电泳，pUCCRNAi-HpLV-d回收小片段约1 000 bp，pCAMBIA2300-35S-OCS回收大片段。经去磷酸化处理进行连接反应，反应体系：pUCCRNAi-HpLV-d小片段5 μL、2300载体大片段1 μL、10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、ddH2O 补齐至 25 μL，16℃连接24 h，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。取200 μL菌液均匀涂抹在含卡那霉素（Kan+）的固体LB培养基上，挑取单菌落于含Kan+的液体LB培养基中，提取质粒进行酶切验证，将验证正确的载体命名为pCAMBIA2300-pUCCRNAi-HpLV-d。
1.5 农杆菌转化及鉴定
通过电击法将目标载体pCAMBIA2300-pUCCRNAi-HpLV-d转入农杆菌GV3101中，低温离心弃上清，用枪轻轻吹打沉淀后吸取100 μL，均匀涂抹在含50 mg/L Kan+、100 mg/L庆大霉素（gentamicin，Gen+）和100 mg/L利福平（rifampicin， Rif+）的LB固体培养基上，28℃恒温培养箱中培养1～2 d。
随机挑取单克隆菌落，接种到含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃、150 r/min 振荡培养12 h，PCR鉴定阳性农杆菌菌株。
1.6 转基因啤酒花愈伤组织的获得及PCR检测
取无菌啤酒花带侧芽茎段剪成1～2 cm大小，阳性农杆菌菌液活化至OD值0.5左右，MS液体培养基重悬后侵染啤酒花茎段10 min，期间不断摇动，倒掉菌液，用灭菌的滤纸吸去茎段上残留的侵染液。将茎段平放在不加任何激素的MS-B5培养基平板上，暗培养2 d。后将茎段移至诱导愈伤的分化培养基上，进行分化、筛选培养，每15 d左右继代培养一次。对获得的抗性愈伤进行PCR检测。
2 结果与分析
2.1 干扰序列的选择
根据刘升学等[3]研究，在GenBank数据库中搜索啤酒花潜隐病毒（HpLV）序列与啤酒花潜隐类病毒（HpLVd）序列，经DNAstar软件比对，找出各自高度保守的序列，利用Target Finder软件选取HpLV及HpLVd基因组大小分别为202、155 bp的序列作为干扰序列，由上海生工生物工程股份公司将两段序列合成至pUC57载体上，分别在序列5′端和3′端加入酶切位点XhoⅠ、BglⅡ，序列全长369 bp，命名为HpLV-d（图3）。
2.2 同步沉默双价RNAi载体的构建
将pUCCRNAi载体和载有HpLV-d片段的pUC57载体分别用XhoⅠ和BglⅡ双酶切，回收片段，进行连接反应，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，取菌液进行PCR筛选，提质粒进行酶切鉴定（图4），结果显示干扰片段HpLV-d成功插入pUCCRNAi载体中。
用BamHⅠ和SalⅠ双酶切已鉴定的pUCCRNAi-Z质粒，与回收的HpLV-d小片段进行连接反应，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，取菌液进行PCR筛选（图5），提质粒用PstⅠ进行酶切鉴定（图6），结果显示反向片段HpLV-d成功插入pUCCRNAi载体中，pUCCRNAi-HpLV-d载体构建成功。
pUCCRNAi-HpLV-d载体构建过程如图7所示。
2.3 植物表达载体的获得
用PstⅠ分别单酶切pUCCRNAi-HpLV-d质粒及pCAMBIA2300-35S-OCS载体，回收目标片段进行连接反应，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，取抗性菌落扩大培养，提取质粒用Pst Ⅰ进行单酶切验证，获得928 bp大小片段（图8），与干扰片段大小吻合，将构建成功表达载体命名为pCAMBIA2300-pUCCRNAi-HpLV-d（图9）。
2.4 农杆菌转化及鉴定
通过电击法将目标载体pCAMBIA2300-pUCCRNAi-HpLV-d转入农杆菌GV3101，对获得的抗性菌株进行PCR鉴定，获得大小相符的预期条带（图10），证明目标载体成功转入农杆菌GV3101菌株中。
2.5 转基因啤酒花愈伤组织的获得与鉴定
利用阳性农杆菌侵染啤酒花茎段，经暗培养、分化培养获得抗性愈伤组织，对获得的抗性愈伤进行PCR检测，结果显示共获得阳性愈伤21块（图11）。
3 讨论与结论
近年来，RNAi技术在植物基因工程研究中得到广泛应用，利用病毒本身基因导入植物从而获得抗病毒植株，是目前植物抗病毒基因工程的常用策略。目前RNAi技术已经在抗大豆花叶病毒[11]、番茄花叶病毒[12]、黄瓜花叶病毒[13]、苜蓿花叶病毒[14]、马铃薯Y病毒[15]、大麦黄矮病毒[16]等方面取得了成功。但在实际生产过程中，多种病毒综合发生的现象很常见，因此仅构建单一的病毒载体往往不能满足实际需求。
Wesley等[10]构建了几种不同的 RNAi载体，并对获得的抑制基因表达的转基因植株进行评价，结果显示，含有两个反向重复序列且中间夹一个内含子所形成的hpRNA结构能显著提高RNA沉默效果，沉默效率平均高达90%。本研究在两个反向重复序列中间有一段大小约199 bp的Intron片段，这种结构保证了干扰片段可以按照完全相反的方向插入到目的载体，并在转化后形成hpRNA结构。在RNAi载体设计中，有关干扰序列长度以及靶标基因片段的选择尚存在争议，还有待于进一步深入研究。本研究中，干扰序列的选择与长度是否合适尚需在后续的工作中对转基因植株进行抗病性鉴定才可知。
本试验将HpLV外壳蛋白编码基因片段与HpLVd控制细胞间运动基因片段进行合成拼接，成功構建出pCAMBIA2300-pUCCRNAi-HpLV-d植物表达干扰载体，并对啤酒花进行遗传转化，经PCR检测获得抗性愈伤21块，为改良啤酒花对两种病毒的抗性奠定了基础。
本研究是通过RNAi转基因技术创制啤酒花抗病毒新材料的前期工作，主要包括RNAi载体的构建和农杆菌介导的啤酒花遗传转化，以及DNA水平上对转基因愈伤的初步检测，目前已获得了部分抗性啤酒花愈伤，许多工作还在进行中，如啤酒花的出芽成苗、转入植株中外源基因的拷贝数、dsRNA和siRNA的存在状况及与获得抗病性的关系等，尚待更为深入的研究验证。
参 考 文 献：
[1] Schmidt H E， Schmidt H B， Eisbein K. The mechanical transmission of a rod-shaped hop virus on herbaccous test plants[J]. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. （AbtII），1966，120（5）：461-466.
[2] Hataya T， Uchino K， Arimoto R， et al. Molecular characterization of Hop latent virus and phylogenetic relationships among viruses closely related to carlaviruses[J]. Arch. Virol.， 2000， 145：2503-2524.
[3] 刘升学， 韩盛， 祝建波， 等. 新疆啤酒花潜隐病毒的检测及外壳蛋白基因的序列分析[J]. 植物病理学报， 2008， 38（3）：333-336.
[4] Yu J， Liu Y. The occurrence of three viruses in hop （Humulus lupulus） in China[J]. Plant Pathology， 1987， 36（1）： 38-44.
[5] 许慧敏， 张燕玲， 王晓燕， 等. 啤酒花潜隐病毒新疆分离物的全基因组序列分析[J]. 石河子大学学报（自然科学版）， 2012， 30（3）： 313-316.
[6] Adams A N， Barbara D J， Morton A， et al. Effects of hop latent viroid on weight and quality of the cones of the hop cultivar Wye Challenger[J]. Annals of Applied Biology， 1991， 118（2）： 126-127.
[7] 连海燕， 汪万春， 骆卫峰， 等. 啤酒花潜隐类病毒北京分离物的分子鉴定和序列分析[J]. 植物检疫， 2014， 28（2）：43-47.
[8] 马建，刘艺苓，王丕武. 植物RNA干扰的研究进展[J].中国油料作物学报， 2008， 30（2）：252-259.
[9] Bernstein E， Caudy A A， Hammond S M， et al. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J]. Nature， 2001， 409（6818）：363-366.
[10]Wesley S V， Helliwell C A， Smith N A， et al. Construct design for efficient， effective and high-throughput gene silencing in plants[J]. The Plant Journal， 2001， 27（6）： 581-590.
[11]许宗宏， 郝青南， 陈李淼， 等. 基于大豆花叶病毒衣壳蛋白基因的 RNA 干扰植物表达载体的构建[J]. 華北农学报， 2010，25（S2）： 1-4.
[12]乔亚红， 田桂英， 郑银英， 等. 抗CMV和ToMV RNAi载体的构建及加工番茄遗传转化[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2014， 42（1）： 102-110.
[13]Kalantidis K， Psaradakis S， Tabler M， et al. The occurrence of CMV-specific short RNAs in transgenic tobacco expressing virus-derived double-stranded RNA is indicative of resistance to the virus[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2002， 15（8）： 826-833.
[14]Tenllado F， Martínez-García B， Vargas M， et al. Crude extracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections[J]. BMC Biotechnology， 2003， 3（1）： 3.
[15]朱俊华， 竺晓平， 温孚江， 等. 马铃薯 Y 病毒衣壳蛋白基因片段长度对 RNA 介导抗病性的影响[J]. 中国科学（C 辑）， 2004， 34（1）： 23-30.
[16]燕飞， 张文蔚， 肖红， 等. 转病毒来源发夹 RNA 小麦表现对大麦黄矮病毒的抗性[J]. 遗传， 2007， 29（1）： 97-102.
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