[摘要]目的：以S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞作为研究材料，研究甜菜碱对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖影响的内在机制。方法：MTT法测S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖程度。ELISA方法检测甜菜碱对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌肿瘤坏死因子α的含量的影响。结果：培养48 h后，甜菜碱在50～5 000 μg/ml，的浓度范围内可促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖反应(P＜0.01)。甜菜碱在浓度为50～500 μg/ml的范围内可促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞TNF-α的产生(P＜0.01)。结论：甜菜碱能够促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖、促进TNF-α的产生，说明甜菜碱的促进增殖作用主要与促进TNF-α的产生有关。
[关键词] 甜菜碱；TNF-α；脾淋巴细胞
[中图分类号] R 969.4 [文献标识码]C [文章编号]1674-4721（2008）12（a）-011-02
甜菜碱的化学名称为N,N,N-三甲基甘氨酸内盐,分子式为C6H11O2N，分子量为117.15。甜菜碱为无色柱状结晶，熔点293℃(分解)，能溶于水和醇。微溶于乙醚，易潮解，有甜味。在浓强碱中产生三甲胺。近些年来发现甜菜碱具有免疫增强作用，并且具有良好的抗肿瘤作用[1]，但其具体机制尚不十分清晰。通过促进脾淋巴细胞的增殖，调节免疫是目前抗肿瘤作用的主要机制之一，近年来免疫调节受到广泛的关注，因此本文将通过甜菜碱对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖作用的影响进行研究甜菜碱的免疫抗肿瘤作用。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物 昆明小鼠雌雄兼用，(20±3) g，SPF级，购自中国农科院哈尔滨兽医研所。
1.1.2药品与试剂 RPMI1640培养基，GIBCO公司产品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；MTT，Sigma公司产品；小鼠S180肉瘤细胞株，黑龙江省肿瘤医院肿瘤研究所；甜菜碱纯度95%，浙江绿成生物技术有限公司；BAY11-7082，碧云天生物技术研究所；SB203580，碧云天生物技术研究所；小鼠肿瘤坏死因子α，ELISA试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。
1.1.3主要仪器JJT-900/1300超净工作台，苏净集团；Olympus IX70 倒置显微镜，Olympus公司；Adventurer万分之一电子天平，OHAUS公司；WELLSCAN MK 3型酶标仪，美国Bio-Rad公司。
1.2实验方法
1.2.1 S180荷瘤小鼠制备吸取生长最佳状态的S180腹水瘤(乳白色)传代细胞，用4℃无菌生理盐水稀释，按细胞数1×108个/ml, 0.2 ml/只，穿过肌肉接种于小鼠右后肢的腹股沟皮下，7 d后取脾脏细胞用于实验。
1.2.2 S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞培养参照文献[2]方法操作，取S180荷瘤小鼠2只，拉颈椎处死，无菌取出脾脏放入盛有少量PBS液的培养皿中，用玻璃注射器捻碎，移入离心管中，用吸管吹打数遍，200目尼龙布过滤，滤液1 500转离心，收集细胞，用PBS液洗3遍，计数，然后用含10%胎牛血清及青、链霉素的RPMI 1640培养基配成8×106个细胞/ml，在已加好待试药物和对照试剂的96孔板中每孔加入上述细胞悬液100 μl，使总体积为200 μl，置培养箱中在饱和湿度 5% CO2 37℃条件下，培养48 h。
1.2.3 MTT法测S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖程度实验分为7组，每组6个样本，即：对照组(第1组)、阳性对照组（第2组）和5种不同浓度的甜菜碱组(5 000、500、50、5、 0.5 μg/ml)(第3～7组)。第1组：含细胞和培养液。第2组：含细胞、培养液、刀豆蛋白A( 10 μg/ml)。第3组：含细胞、培养液、甜菜碱 (0.5 μg/m1) 。第4组：含细胞、培养液、甜菜碱 ( 5 μg/m1)。第5组：含细胞、培养液、甜菜碱 (50 μg/ml)。第6组：含细胞、培养液、甜菜碱 (500 μg/ml)。第7组：含细胞、培养液、甜菜碱 (5 000 μg/m1)。
总共培养48 h，S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞培养结束前，每孔加入5%MTT(生理盐水配制)20 μl ，继续培养4 h，弃上清，然后每孔加0.04 N盐酸-异丙醇200 μl ，振荡20 min使MTT的紫色还原产物完全溶解。最后用酶标仪在490 nm处测定光密度，结果用490 nm处的光密度值(A490)表示。检测细胞增殖情况。
1.2.4 ELISA方法检测甜菜碱对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌肿瘤坏死因子α的含量的影响实验分为4组，每组6个样本。第1组：仅含细胞和培养液。第2组：甜菜碱低浓度组。含细胞、培养液、甜菜碱(50 μg/ml)。第3组：甜菜碱中浓度组。含细胞、培养液、甜菜碱(100 μg/ml)。第4组：甜菜碱高浓度组。含细胞、培养液、甜菜碱( 200 μg/ml)。总共培养24 h，收集上清。取酶标板每孔加样品或标准品100 μl，37℃反应90 min后，每孔加生物素标记抗体100 μl，37℃反应60 min，PBS洗涤3次，每孔加稀释液100 μl，37℃反应30 min， PBS洗涤5次，每孔加显色液90 μl 37℃反应15～20 min，每孔加入终止液100 μl，酶标仪450 nm测定OD，计算TNF- α的含量。
1.2.5数据统计结果用均数±标准差(x±s)表示。采用t检验对数据进行分析。
2实验结果
2.1甜菜碱对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
实验分为7组，每组6个样本，即:阴性对照组(第1组)，阳性对照组（刀豆蛋白A，第2组）和5种不同浓度的甜菜碱组(5 000，500，50，5， 0.5 μg/ml)(第3～7组)。
为了研究甜菜碱的免疫学抗肿瘤机制，我们首先观察了甜菜碱对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。结果发现甜菜碱在5～5 000 μg/ml的浓度范围内均可显著促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖反应(P＜0.01 )，随着浓度的增大其促进作用也相应增强，见表1。
2.2甜菜碱对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响
实验分为4组，每组6个样本。第1组：阴性对照组，仅含细胞和培养液。第2组：甜菜碱低浓度组。含细胞、培养液、甜菜碱(5 μg/m1)。第3组：甜菜碱中浓度组。含细胞、培养液、甜菜碱(50 μg/m1)。第4组：甜菜碱高浓度组。含细胞、培养液、甜菜碱(500 μg/m1)。总共培养24 h，收集上清检测TNF-α的含量。
TNF-α具有多种生物学活性，在肿瘤免疫反应中发挥重要的作用，可直接导致肿瘤细胞的死亡。甜菜碱可促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖，但能否促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌TNF-α并不确定。为此，观察了甜菜碱对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌TNF-α的影响。结果表明，甜菜碱在浓度为50～500 μg/ml的范围内可促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞TNF-α的产生(P＜0.01)，见表2。
3讨论
甜菜碱显著促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖促进TNF-α的产生。TNF-α可使巨噬细胞活化，增强其吞噬和杀伤等活性[3]，同时也具有细胞毒作用能促进中性粒细胞活化在免疫应答效应阶段具有重要作用，肿瘤坏死因子α还可直接杀伤肿瘤细胞[4,5]。所以能够促进免疫细胞活化，促进TNF-α的产生已经成为抗肿瘤作用的重要机制。在本实验中甜菜碱在5～5 000 μg/ml的浓度范围内均可显著促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖反应(P＜0.01 )，随着浓度的增大其促进作用也相应增强。说明甜菜碱具有较好的免疫增强作用，当甜菜碱在浓度在50～500 μg/ml的范围内可显著促进S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞TNF-α的产生(P＜0.01)。因此可以认为促进TNF-α的产生就是甜菜碱抗肿瘤作用的主要机制之一。这一实验所得到的结果具有较好的科研参考价值，在目前对付肿瘤还没有特效药的情况下，甜菜碱没有一般化疗药物的毒性，所以它极有可能成为肿瘤辅助治疗的一种新药。
[参考文献]
[1]Pouwels PH,LeerRJ,Shaw M,et al.Lactic acid bacteria as antinen delivery vehicles for oral immunization purposes[J].Int J Food Microbiol,1998, 41( 2):155-167.
[2]张群,雷林生.灵芝多糖抗肿瘤作用的免疫分子机制研究[D].第一军医大学, 2006.
[3]Brint EΚ,Xu D,liu H,et al.ST2 is aninhibitor of interleuκ in L recaptor and Toll-liκe receptor 4 signaling and maintains endotoxin tolerance[J].Nat Immunol,2004,5(4):373-379.
[4]韩雅玲,张效林,康建.核因子-κB及Toll样受体4介导脂多糖诱导内皮细胞单层通透性增高[J].中国临床康复,2004,8(6):1063-1065.
[5]严明,陈万涛.NF-κB信号转导通路和肿瘤发生、转移关系的研究进展[J].北京腔医学2007，15（1）：53-55.
（收稿日期：2008-11-26）
推荐访问： 淋巴细胞 小鼠 增殖 影响 甜菜碱
