棉酚对迟发型超敏反应小鼠模型Th17/Treg细胞亚群的影响

材料

1.实验动物

健康BALB/c小鼠，6周龄，雌雄各半，体重18～20 g。饲养环境温度22±1℃，自由进食，饮水。

2.化学试剂

荧光标记的抗小鼠CD4、IL-17A、CD25单克隆抗体（BD PharMingen）；荧光标记抗小鼠Foxp3单克隆抗体（eBiosciences）；胎牛血清（杭州四季青公司）；1%多聚甲醛；RPMI 1640；棉酚。

3.主要仪器设备

流式细胞仪（美国Becton）；CO2细胞培养箱（日本Sanyo公司）；AE 30显微镜（日本Olympus）；微量移液器（1000 µL，200 µL，10 µL）（美国Thermo公司）；AE 160型电子分析天平（瑞士Mettler公司）；XW-100A漩涡混合器（上海精科实业有限公司）。

二、方法

1.DTH小鼠模型的建立

建立小鼠DTH模型，将BALB/c小鼠腹部剃毛，面积约1×1 cm2，使用胶带黏贴数次以使小鼠致敏部位充分暴露。在去毛部位涂5%的DNFB（DNFB 在临用前用4：1的丙酮：橄榄油配制）50 µL，以单独涂布丙酮/橄榄油溶剂作为空白对照，每天1次，连续2 d，诱导小鼠超敏反应。在致敏后第5 d使用10 µL的5% DNFB涂布小鼠右耳背进行激发试验。同时将小鼠左耳涂等量的丙酮/橄榄油溶剂作为对照，24 h后DTH小鼠模型建立成功。

2.动物分组及给药方案

将BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只：空白组、DTH模型组、棉酚（GOS）药物低剂量组，中剂量组，高剂量组。以二硝基氟苯（DNFB）为致敏原，通过两次诱导激活对抗原敏感的T淋巴细胞。从第一次DNFB诱导致敏开始，GOS药物组每天腹腔注射GOS，连续7 d，空白组给予同样剂量的生理盐水。

3.HE染色检测耳廓肿胀程度

24 h后小鼠脱颈处死，剪下小鼠右耳，将石蜡切为4 mm厚的片，做HE染色，检测DTH小鼠超敏反应程度。

4.CD4+ T淋巴细胞分离纯化

（1） 磁珠标记。取小鼠脾脏制备脾淋巴细胞悬液，每107个细胞用90 µL缓冲液重悬细胞，加入CD4磁珠标记细胞，孵育15 min；向其中加入抗CD4抗体，避光4℃孵育5 min；加入PBS洗涤细胞去除残余抗体，离心细胞并弃上清液，使用500 µL缓冲液重悬细胞。

（2） 磁珠分选。将磁珠分选器放入无菌操作台上，将MS柱于固定在分选器磁场中，离心管在MS柱下，使用1 mL缓冲液冲洗MS柱，加缓冲液清洗时小心操作，尽量不要带入气泡；MS柱内加入已经标记好的细胞悬液，收集悬液；冲洗MS柱两次，每次使用500 µL缓冲液；将MS柱从磁珠分选器上移走，被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。向MS柱中加入1 mL缓冲液，立即使用推拉器冲洗，将滞留柱内的磁性标记细胞洗脱出来，此细胞为目标细胞；取目标细胞1 µL，台盼蓝染液9 µL，充分混匀并加入到细胞计数板上，染色3 min内进行观察，染成蓝色的为死细胞，无色透明状为活细胞。将细胞密度调整为4×105个cell/mL。

5.流式细胞仪对细胞的定量检测实验

（1） Treg细胞检测。取细胞悬液100 µL，加10 µL CD4-PE、10 µL CD25-PE-Cy5后混匀，避光4℃孵育30 min，用预冷PBS洗涤后再加入1 mL经过稀释的固定、透膜剂，反应40 min后以透膜缓冲液洗涤并重悬细胞，再加入10 µL FITC标记的Foxp3抗体（同时设同型对照反应管），反应30 min后洗涤，以400 µL预冷PBS重悬，上机检测分析。

（2）Th17细胞检测。取细胞悬液100 µL，加入10 µLCD4-FITC，避光4℃孵育30 min，洗涤细胞，再加入100 µL固定，透膜剂A，避光4℃孵育30 min后洗涤细胞，再加入固定，透膜剂B 100 µL，避光4℃孵育30 min后無需洗涤直接加入10 µL FITC标记的抗人IL-7抗体（同时设同型对照反应管），避光4℃孵育30 min后洗涤，加入400 µL预冷的PBS重悬，进行流式细胞仪测定分析。

6.统计学方法

数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，差异显著性采用SPSS 13.0的单因素方差分析和双尾学生T检验进行分析，阳性对照组与阴性对照组样本均数间具显著性差异的用#P<0.05或##P<0.01进行标识；各剂量药物组与阳性对照组样本均数间具显著性差异的用*P<0.05或**P<0.01进行标识，结果均重复操作3次。

三、结果与分析

1.棉酚（GOS）对致敏性小鼠的耳廓肿胀影响

结果如图1所示，与正常组相比，DTH组表皮，真皮及皮下组织密集炎症细胞浸润，以单一核细胞为主，可见较多坏死灶，结构不清楚，其内分布有中性粒细胞。毛细血管扩张，组织间充血，红细胞渗出较多，分布广泛。而在GOS药物作用下，发现随治疗剂量的增加，程度越来越轻。说明GOS有免疫抑制作用，对于小鼠的迟发型超敏反应有明显的改善。

图1 GOS对小鼠耳廓肿胀程度的影响

A.空白对照组；B.DTH组；C. 5 mg/kg的GOS；D. 10 mg/kg的GOS；E. 20 mg/kg的GOS

2.GOS对小鼠Th17和Treg细胞数量的影响

流式细胞仪检测DTH模型小鼠Th17/CD4+ T与Treg/CD4+ T细胞百分比见表1。小鼠Treg细胞数量的百分比显著降低（P<0.01）。与模型组对比，低剂量组Th17细胞百分比降低，但效果不显著；中剂量组下的小鼠Th17细胞数的百分比降低（P<0.05）；高剂量组的小鼠Th17细胞数百分比显著降低（P<0.01）。经棉酚作用后，低剂量组的小鼠Treg细胞所占百分比升高（P<0.05），中、高剂量组的小鼠Treg细胞的比例显著升高（P<0.01）。

3.棉酚对小鼠Th17和Treg细胞平衡的影响

小鼠Th17/Treg细胞的比值见图2，与空白组相比，DTH组Th17/Treg细胞比值显著增加，Th17和Treg细胞亚群失衡，小鼠发生超敏反应显著，药物棉酚作用后，Th17和Treg细胞亚群的比例接近空白组小鼠的比例。结果说明，棉酚能够调节小鼠Th17和Treg细胞亚群比例。

四、结语

免疫系统由免疫器官，免疫细胞和免疫分子组成，若机体免疫系统出现紊乱，不能维持机体的免疫平衡，异常的免疫应答就会损害机体本身，就会导致由自身抗原激活免疫系统形成新的疾病，称之为自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AIDs）。针对于自身免疫性疾病而研发出来的药物称为免疫抑制药物，是一类对机体免疫应答反应有抑制作用的药物，能够通过抑制与免疫反应有关细胞的增殖和功能，来降低机体的免疫反应[7， 8]。

DTH是多种细胞因子参与的炎症反应，Th1/Th2型细胞因子在DTH发病机理中起着重要的作用。目前Th1/Th2的失衡理论仍存在争议，新的Th17细胞亚群及Treg细胞介导的免疫平衡失调在自身免疫性疾病发病机制中的作用引起关注。Th17是一种新发现的能够分秘IL-17（interleukin 17）T细胞亚群，IL-17可以促进T细胞的激活和刺激上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞产生多种细胞因子，从而导致炎症的产生。多的Th17激活将会导致自身免疫性疾病，比如类风湿关节炎或Arthus反应等属此类，在自身免疫性疾病和机体防御性反应具有重要的意义。Treg细胞是一类发挥免疫抑制功能的T细胞，能够有效抑制和调节机体效应淋巴细胞的增值，活化。Treg细胞可分为CD4+CD25+ Treg细胞、Tr1和Th3等多种亚型，CD4+CD25+ Treg细胞是最主要的一群[10， 11]。本研究前期发现，棉酚对DNFB诱导的DTH小鼠耳廓肿胀度有明显的抑制效果。实验结果显示，棉酚能明显降低小鼠脾脏CD4+ CD25+ Treg细胞数/CD4+ T 细胞数的比例，尤其以中、高剂量组升高最明显。Th17细胞的特征表现为炎细胞亚类，棉酚能够上调Treg细胞的数量，通过诱导Treg细胞拮抗Th17细胞发挥免疫抑制作用，明显减轻小鼠的超敏反应，表明棉酚能够调节Treg/Th17细胞失衡，具有良好的免疫抑制活性。

参考文献：

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