材料基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试病原菌和质粒 巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（B. & C.）Wei]单孢菌株CC004，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。潮霉素B（HmB）抗性基因hygB来源于质粒pCT74[8]，由美国Oregon大学Ciuffetti博士提供。
1.1.2 供试药剂和培养基 Fungal gDNA Kit、Mini Plasmid Kit为BioMiga产品；pMD18-T simple vector、E. coli JM109、X-Gal、IPTG、XhoⅠ、EcoRⅠ、Marker DL 2 000、Marker DL 15 000均为TaKaRa产品；2×HS Taq-Mixture Kit、TIANgel Midi Purification Kit为TIANGENE产品。潮霉素B为Roche进口分装，Ampicillin为Amresco进口分装。溶壁酶购自广东省微生物研究所。用于制备PDA、PDS、PD培养液、LB培养基的试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 GFP标记多主棒孢菌的策略与方法 从pCT74质粒上酶切hygB：：gfp片段需要限制性内切酶XhoⅠ（CTCGAG）和EcoRⅠ。在CC004菌株的ITS序列上[4]，只存在EcoRⅠ，而无XhoⅠ位点，但在第324～329位点有与XhoⅠ位点相似的序列TTCGAG，若通过设计引物（5ITG-F/5ITG-R、3ITG-F/3ITG-R、C-ITG-F/C-ITG-R），将该位点的碱基T定点突变为C，即可获得含XhoⅠ酶切位点的ITS新序列（命名ITG）。将ITG克隆至pMD18T-simple vector上（pITG），再用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切pITG和pCT74，回收线性化pITG和hygB：：gfp片段，通过T4连接酶将hygB：：gfp插入pITG，即可获得重组质粒pITGH。再用pITGH转化CC004菌株原生质体，因其hygB：：gfp两侧为ITS部分序列，所以可通过同源重组将hygB：：gfp整合入CC004菌株的ITS序列上，最终获得gfp标记的多主棒孢菌（图1）。引物见表1，扩增体系（50 μL）：2×HS Taq Mixture 25.0 μL，上/下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，模板1.0 μL（扩增5ITG和3ITG片段时以CC004菌株总DNA为模板，扩增ITG片段时以回收的5ITG和3ITG产物为模板），ddH2O 20.0 μL。5ITG、3ITG、ITG片段扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火温度（Tm）及时间（t）见表1，72 ℃ 1.5 min，35个循环；72 ℃ 10 min。gfp检测程序：96 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。其余操作见相应试剂盒。
1.2.2 重组质粒pITGH的PCR鉴定 用pMD18-T simple vector通用引物RV-M/M13-47检测，并将符合预期的重组质粒寄往深圳华大基因科技服务有限公司测序，进一步证实序列的正确性。
1.3 pITGH转化多主棒孢菌菌株CC004原生质体
1.3.1 CC004菌株对潮霉素B的敏感性测定 在含20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的Hm B的PDA培养基上接种菌饼，28 ℃培养7 d，确定Hm B对CC004菌株的最低抑菌浓度。
1.3.2 CC004菌株原生质体制备及其PEG介导的转化与再生 参考刘晓妹[3]的方法，制备CC004菌株原生质体，使其浓度为2×107～3×107个/mL，立即转化，即在10 mL无菌尖底离心管中，加入100 μL原生质体、40 μL pITGH质粒、50 μL 2×STC溶液，轻轻混匀后，冰浴20 min，加入2 mL 60% PEG 4000溶液，轻轻混匀，室温放置10～20 min，再加入适量PDS 再生培养液，使最终总体积为5 mL，轻轻混匀，封口后在28 ℃培养箱光照培养36 h，取1 mL涂抹于含80 μg/mL Hm B和适量链霉素的PDS平板上，共涂抹5皿，28 ℃黑暗培养10～15 d后，挑取单菌落在激光共聚焦显微镜下镜检荧光。
1.3.3 GFP标记菌株的荧光稳定性检测 选择绿色荧光最强的菌落，单孢纯化后在不含Hm B的PDA培养基上连续7次转接培养，在培养的初期（2 d）、中期（5 d）和后期（10 d），镜检其荧光稳定性并拍照。
1.3.4 GFP标记菌株的PCR鉴定 先用gfp基因特异性引物P28、P29检测1.3.3获得的单孢菌株，再从插入片段的外侧ITS序列上设计引物，即标记菌株特异性检测引物ITSHG-F/ITSHG-R，检测并测序扩增产物，以证实hygB：：gfp基因插入了标记菌株的ITS序列中。
1.3.5 GFP标记菌株的菌落形态观察和致病性测定
将标记菌株和野生型菌株在不含Hm B的PDA培养基上28 ℃培养5 d后，观察菌落形态和大小。再用无菌水洗下配成2 000个孢子/mL的悬浮液，刺伤接种巴西橡胶树感病品种‘RIM600’嫩绿色叶片，28 ℃保湿培养，定时观察。用无菌水作空白对照。每处理重复5片叶。
2 结果与分析
2.1 多主棒孢菌菌株CC004的5ITG、3ITG和ITG片段扩增结果
图2表明，5ITG、3ITG、ITG扩增条带的大小分别约为230、280、480 bp ，符合预期。测序表明：大小477 bp的ITG序列在第210位点（ITS第324位点）的碱基T被突变为了碱基C，具备了XhoⅠ的酶切位点。
2.2 重组质粒pITGH的PCR鉴定
用引物M13-47和RV-M从重组质粒pITGH上扩增获得约3 400 bp的片段（图3），说明hygB：：gfp（3.0 kb）片段已插入了ITG（477 bp）的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，测序表明重组质粒pITGH-3序列完全正确，可以用于后续转化。
2.3 gfp基因转化多主棒孢菌菌株CC004原生质体
2.3.1 CC004菌株对潮霉素B的敏感性测定
CC004菌株在含Hm B的PDA平板上培养7 d，结果表明：Hm B对CC004菌株的最低抑菌浓度为80 μg/mL。
2.3.2 GFP标记菌株的荧光稳定性检测 连续7次转接培养后，用激光共聚焦显微镜观察GFP标记菌株，仍可在培养初期、中期和后期的分生孢子及其萌发的芽管、分生孢子梗以及菌丝体中观察到强烈的绿色荧光（图4）。说明gfp基因在CC004菌株中能稳定遗传和表达。
2.3.3 GFP标记菌株的PCR鉴定 提取转化子菌株基因组DNA后，用gfp特异性引物P28/P29进行PCR检测，得到约400 bp的预期片段，而在野生菌株中未扩增出此条带（图5），可见gfp基因已整合到了转化子基因组中。再用标记菌株特异性检测引物ITSHG-F/ITSHG-R检测，在转化子和野生菌株中分别扩增到约3 300 bp和520 bp的预期片段（图6），说明转化子得到了完全纯化，且hygB：：gfp基因插入了标记菌株的ITS序列中，此结果被扩增产物的后续测序结果进一步得到了证实。
2.3.4 GFP标记菌株的菌落形态观察和致病性测定
由图7可以看出，GFP标记菌株与野生型的菌落形态和大小略有差别，但差异不明显；其致病性与野生型菌株也无明显差别，均能引起典型坏死斑（图8），说明本试验用GFP标记CC004菌株获得成功。
3 讨论与结论
本研究结果表明，经转化的菌株在选择压为80 μg/mL的Hm B 平板中央都长出了菌落，几乎都能发出绿色荧光，转化成功率约100%。然而，在培养基边缘，尤其是培养皿壁上长出的菌落基本上都不发光，可能与倒平板时在边缘或壁上产生的冷凝水不含Hm B有关。因此，建议筛选时应以平板中央为主，或涂板时注意，要尽量在平板中央小范围涂抹，以免溅入冷凝水中生长，造成假阳性。
人们普遍采用含绿色荧光蛋白基因gfp的载体如pCT74转化目标菌的方法来标记目标菌[9-10，12]，但其随机性强，有可能会将gfp基因插入到目标菌的一些功能基因组上而破坏了这些基因的正常表达和调控，进而影响到后续研究数据的准确性。rDNA-ITS序列是真核生物核糖体上5.8 S rDNA和18 S rDNA之间的插入间隔序列，为冗余功能的保守重复序列。本研究利用定点突变改造ITS序列后，构建了gfp标记载体pITGH，借助该载体上两侧的ITS部分序列，通过同源重组将hygB：：gfp基因标记到CC004菌株的ITS序列上，不仅充分利用了ITS多拷贝、易克隆等优点、提高了标记成功率，同时又降低了因随机插入产生不良影响的概率，所获得的标记菌株更能代表野生型菌株的原始特性，值得推荐。
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