摘要 本文优化了小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备与再生条件。结果表明：小麦矮腥黑粉菌的冬孢子在土壤浸提液固体培养基中萌发后转接入T19液体培养基，培养45 d，以菌丝作为酶解初始材料，用1.5%崩溃酶+1.5%溶壁酶+1.5%蜗牛酶复合酶液28℃酶解2.5 h原生质体的获得率最高；以1.2 mol/L的氯化钾为渗透压稳定剂，所得原生质体数量最多，且释放的原生质体能均匀分散分布，不聚集成堆；小麦矮腥黑粉菌的原生质体在TB3培养基上能长出较多的单菌落。
关键词 小麦矮腥黑粉菌； 原生质体； 制备； 再生
中图分类号： S 435.121
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017239
Abstract Protoplast is the receptor cells for genetic transformation of fungi. To establish protoplast-mediated genetic transformation system of Tilletia controversa， conditions for the protoplast isolation and regeneration of T.controversa were optimized， including incubation time， various enzymes， digestion time and osmotic stabilizers. The results showed that T.controversa teliospores cultured in soil extract medium for 45 days and then transferred into T19 medium were most suitable for protoplast release. The mixture solution of 1.5% driselase， 1.5% lyase and 1.5% snailase was most favorable for protoplast preparation. The suitable incubation time with enzyme for the maximum release of protoplasts was 2.5 h at 28℃. The most effective osmotic stabilizer for the protoplast release was 1.2 mol/L KCl， and protoplast was also well dispersed. For the regeneration of the protoplast， TB3 medium was the best， which can produce more single colony under the same condition.
Key words Tilletia controversa； protoplast； preparation； regeneration
小麥矮腥黑穗病（wheat dwarf bunt disease， DB）是由小麦矮腥黑粉菌Tilletia controversa Kühn（TCK）引起的重要国际检疫性病害[1]，是麦类黑穗病中危害最大、极难防治的检疫性病害之一，可对小麦生产造成毁灭性危害。小麦矮腥黑粉菌也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一。感病植株通常矮化、多分蘖，麦粒内含黑色、有鱼腥味的冬孢子[2]。国内外对于小麦矮腥黑穗病的研究主要集中在病原菌的鉴定、生物学特性及分子检测技术等方面[38]，而对该病原菌的遗传转化研究较少。遗传转化技术是实现大规模定点突变的重要方法，利用该技术能够使真菌的遗传物质发生改变，研究植物病原菌的致病机理。目前，进行真菌遗传转化的方法很多，常见的有聚乙二醇介导的原生质体转化、限制性内切酶介导的整合以及农杆菌转化等[911]。原生质体的制备和再生直接关系到转化能否顺利进行。小麦矮腥黑粉菌生长缓慢，其原生质体制备较难成功，目前还未有小麦矮腥黑粉菌原生质体制备成功的报道。本试验采用酶解细胞壁的方法制备了小麦矮腥黑粉菌原生质体，研究了原生质体制备和再生的适宜条件，以期能稳定快速地制备小麦矮腥黑粉菌原生质体，为建立该病原菌的遗传转化体系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株
小麦矮腥黑粉菌菌株，由中国农业科学院植物保护研究所麦类真菌病害研究组保存并提供。
1.2 培养基
2%土壤浸提液培养基：称取75 g灭菌土壤加500 mL沸水过滤后，加入20 g琼脂粉，蒸馏水定容至1 L。
T19培养基：称取磷酸二氢钾613 mg，七水硫酸镁246 mg，磷酸氢二钾114 mg，氯化钙55.5 mg，螯合铁20 mg，七水硫酸锌3.52 mg，五水硫酸铜0.38 mg，硫酸镁0.31 mg，二水钼酸钠0.025 mg，氯化硫胺素5 mg， L-天冬酰胺3 mg，蔗糖20 mg，蒸馏水定容至1 L。固体培养基中加入20 g琼脂粉。
马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）：称取PDA粉末（购自北京奥博星生物技术有限公司）37 g，蒸馏水定容至1 L。
TB3培养基：酵母提取物3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，酵母粉10 g，蒸馏水定容至1 L。
以上培养基均经121℃高压蒸汽灭菌20 min后使用。
1.3 常用试剂
溶壁酶（lysing enzyme）、崩溃酶（driselase）购自Sigma公司，蜗牛酶（snailase）购自上海生化所，硫酸镁、氯化钾、山梨醇、蔗糖以及T19培养基中的试剂均为国产分析纯。
1.4 试验方法
1.4.1 小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备
本试验采用酶解细胞壁法制备小麦矮腥黑粉菌的原生质体。用土壤浸提液培养基培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子。用灭菌蒸馏水冲洗萌发的冬孢子转入T19液体培养基中，在恒温振荡器中5℃、150 r/min振荡培养。离心收集菌丝，取1 g加入到不同组合的复合酶液中，28℃、180 r/min振荡酶解。每隔30 min，用血球计数板观察原生质体，计算获得率。设置菌丝培养时间、裂解酶系统、酶解时间、渗透压稳定剂以及适合再生的培养基等试验参数，优化原生质体制备体系。
1.4.2 菌丝培养时间对小麦矮腥黑粉菌原生质体制备的影响
将在土壤浸提液培养基上萌发的小麦矮腥黑粉菌冬孢子转接到T19液体培养基中振荡培养40、45、50、55、60 d，然后加入用1.2 mol/L氯化钾配制的酶液（1.5%崩溃酶+1.5% 蜗牛酶+1.5% 溶壁酶），酶解3 h后观察原生质体获得率，选出最适宜制备小麦矮腥黑粉菌原生质体的菌龄。
1.4.3 细胞壁裂解酶对小麦矮腥黑粉菌原生质体制备的影响
用1.2 mol/L氯化钾分别配制1.5%崩溃酶、1.5%溶壁酶和1.5%蜗牛酶，将酶液加入到培养45 d的菌丝中，28℃、180 r/min振荡培养，3 h后计算原生质体获得率，研究单一酶和不同组合的酶对小麦矮腥黑粉菌原生质体产量的影响。
1.4.4 酶解时间对小麦矮腥黑粉菌原生质体制备的影响
将配制好的酶液（1.5% 崩溃酶+1.5% 蜗牛酶+1.5% 溶壁酶）加入到培养45 d的菌丝中，28℃、180 r/min振荡培养，设置酶解时间分别为1、1.5、2、2.5、3 h，显微镜检观察是否获得原生质体以及原生质体的数量。
1.4.5 渗透压稳定剂对小麦矮腥黑粉菌原生质体制备的影响
分别选择1.2 mol/L硫酸镁、氯化钾、山梨醇、蔗糖作为渗透压稳定剂，以1.5%崩溃酶、1.5%溶壁酶和1.5%蜗牛酶为细胞壁裂解酶，28℃、180 r/min振荡培养，酶解2.5 h，观察不同渗透压稳定剂对小麦矮腥黑粉菌原生质体制备的影响。
1.4.6 小麦矮腥黑粉菌原生质体的再生
以1.5%崩溃酶、1.5%溶壁酶和1.5%蜗牛酶为细胞壁裂解酶，以1.2 mol/L氯化钾为渗透压稳定剂，28℃、180 r/min振荡酶解培养45 d的菌丝，将酶解2.5 h后所得原生质体配制成浓度为1×105个/mL，取200 μL涂布在PDA和TB3平板上，5℃培养箱中培养，观察长出的单菌落。
1.5 數据处理
使用Excel对所得数据进行处理，制作柱形图和散点图。利用DPS软件将不同裂解酶种类下所得到的原生质体数量进行LSD多重比较分析。
2 结果与分析
2.1 原生质体的释放过程
在酶解初始阶段，菌丝在裂解酶的作用下开始向内凹陷，呈节状断裂（图1a）。薄弱的细胞壁比较容易被酶解而发生变形，因此，原生质体通常从细胞壁比较薄弱的位置释放。显微镜下观察可知，多数小麦矮腥黑粉菌的原生质体从菌丝的顶端开始释放（图1b）。随着酶解进行，细胞壁逐渐被完全酶解，原生质体没有细胞壁的束缚，在释放后呈圆形透明的小球。小麦矮腥黑粉菌在酶解2.5 h后，大部分原生质体从菌丝上释放出来（图1c）。
2.2 菌龄对原生质体获得率的影响
试验结果表明，在相同处理条件下，随着培养天数的增加，原生质体的数量呈先增后减的状态，在菌龄为45 d时原生质体数量达到最多，为12.0×105个/mL（图2）。若培养时间较短或较长，均不利于原生质体的大量生成。
2.3 裂解酶系统对原生质体获得率的影响
原生质体的产量受细胞壁裂解酶的种类和浓度的影响较大，且混合酶的作用效率高于单一酶。在单一酶作用时，1.5%崩溃酶所得小麦矮腥黑粉菌的原生质体数量最多，为3.0×105个/mL；1.5%溶壁酶所得原生质体数量最少，为2.4×105个/mL；两种酶混合时，原生质体的数量比单一酶有所提高；三种酶混合时，得到的原生质体数量最多，为11.5×105个/mL（表1）。因此，在小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备中，选择崩溃酶、溶壁酶和蜗牛酶三种酶混合使用效果较好。
2.4 酶解时间对原生质体获得率的影响
采用1.5%崩溃酶+1.5%溶壁酶+1.5%蜗牛酶为酶解系统，酶解3 h，每隔0.5 h观察原生质体的数量。结果表明：原生质体数量随着酶解时间的增加而先增后减，酶解2.5 h时原生质体的数量达到最大值，为9.5×105个/mL。
2.5 渗透压稳定剂对原生质体获得率的影响
不同类型的渗透压稳定剂对产生原生质体制备的影响不同（图4）。相同条件下，所选的4种渗透压稳定剂中无机溶剂比有机溶剂的原生质体获得率更高，且以山梨醇和蔗糖作为渗透压稳定剂所得原生质体易聚集（图5）；以氯化钾为渗透压稳定剂时所得原生质体数量最多，为10.8×105个/mL。
2.6 原生质体再生
小麦矮腥黑粉菌原生质体在PDA和TB3培养基上的再生情况不同（图6）。在TB3培养基中5℃培养2周后长出单菌落，而在PDA上无单菌落长出，说明TB3培养基能够再生出小麦矮腥黑粉菌，可用于小麦矮腥黑粉菌原生质体的再生培养。
3 讨论
本文优化了小麦矮腥黑粉菌原生质体制备的条件，确定了制备原生质体的最适宜条件：小麦矮腥黑粉菌冬孢子在土壤浸提液培养基上萌发后转接至T19液体培养基，以培养45 d的菌丝作为原生质体制备的初始材料，采用1.5%崩溃酶+1.5%溶壁酶+1.5%蜗牛酶酶解2.5 h，以1.2 mol/L氯化钾为渗透压稳定剂，以TB3为再生培养基。
研究发现在小麦矮腥黑粉菌原生质体制备中，原生质体的数量随着酶解的进行先增后减，在2.5 h时原生质体数量达到最大值，若继续酶解，原生质体数量将减少，而且酶解时间过长会造成原生质体破裂[1213]。真菌细胞壁成分复杂多样，单一酶的裂解效果较差，在小麦矮腥黑粉菌的原生质体制备中，选取3种酶混合时，原生质体获得率较高，这与周礼红等人[14]的研究结果一致。本研究中，原生质体的制备中以无机溶剂作为渗透压稳定剂的效果比有机溶剂好，且得到的原生质体分散分布，这与玉米丝轴黑穗菌原生质体制备的结果有差异[15]。
制备真菌原生质体一般都采用新鲜的组织[16]。小麦矮腥黑粉菌的冬孢子需先在固体培养基中萌发，再将萌发长出的菌丝转移到液体培养基中培养，才能获得较多菌丝。小麦矮腥黑粉菌生长较慢，培养所用的时间较长，一般在固体培养基中萌发所需要的时间为30～35 d ，因此，在固体培养基或液体培养基中培养45 d的菌丝属于较幼嫩菌丝，比较适合破壁。小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发后先产生先菌丝和初生担孢子，之后亲和性初生担孢子异宗配合，成对结合成“H”型，并产生侵染菌丝[17]，侵染菌丝易被酶解。如果培养时间过长，菌丝的细胞壁老化，成分改变，裂解酶系统对其作用不显著，原生质体的获得率较低[18]。在小麦矮腥黑粉菌的原生质体的制备中，应该综合考虑各方面的因素，优化原生质体的制备方法，以期为建立小麦矮腥黑粉菌的遗传转化体系奠定基础。
参考文献
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（责任编辑：杨明丽）
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