[摘要] 目的 研究氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导小鼠心脏内皮细胞炎性反应中Toll样受体（TLR）2的表达。 方法 分离小鼠心脏内皮细胞，对照组给予DMEM培养，干预组分别给予不同浓度的ox-LDL（20，40 μg/mL）作用细胞24 h，采用Western blot法检测细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、TLR2的表达，利用ELISA方法检测炎症因子白细胞介素（IL）-6、IL-8的变化。 结果 与对照组相比，ox-LDL干预组TLR2蛋白表达减少（P < 0.01），ICAM-1蛋白表达增多（P < 0.01），IL-6和IL-8表达明显增加（P < 0.05）；与低浓度组比较，高低浓度组ICAM-1、IL-6和IL-8表达差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 ox-LDL可以诱导小鼠心脏内皮细胞的炎性反应，同时可能抑制了TLR2受体的表达。
[关键词] 氧化低密度脂蛋白；心脏内皮细胞；炎性反应；Toll样受体2
[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）12（b）-0027-04
在当代，冠心病已成为威胁人类健康和生命的常见病。冠心病的基础病理变化是冠状动脉粥样硬化。动脉粥样硬化被认为是一个慢性炎性反应过程，与免疫反应息息相关，包括固有免疫和适应性免疫。近期研究发现，Toll样受体家族（Toll-like receptors，TLRs）通过识别病原体相关受体模式，可以介导固有免疫和适应性免疫的发生。TLRs是一种病原体功能识别的跨膜受体，可以识别细菌、病毒以及其他一些病原体[1]，在免疫应答和介导内皮细胞的炎性反应中有着很重要的作用，其中，在心脏中发现TLR2和TLR4受体的存在。研究证据表明，TLR2参与动脉粥样硬化的启动和发展过程。TLR2通过下游通路参与泡沫细胞的形成，另外，TLR2的激活物肽聚糖（peptidoglycan，PGN）已被发现存在于血管早期粥样硬化斑块中[2-3]。
众所周知的是，ox-LDL是参与动脉粥样硬化的基本物质，高水平ox-LDL作为动脉粥样硬化高危因素之一，其可以通过破坏细胞间连接、减少NO释放和促进单核细胞入侵，促进内皮细胞慢性炎症损伤反应，最终导致动脉粥样硬化的进展[4-5]。目前的研究发现，ox-LDL可以结合几种受体，包括SR-A1，SR-A2和凝集素样低密度受体（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor，LOX-1），从而诱导炎性反应的发生[6-7]。在外周单核细胞中，oxLDL已经被证实可以上调TLR2/4受体的表达，其下游因子NF-kapaB和炎症因子IL-6也受到ox-LDL的调控[8]。而已有报道证实，ox-LDL可以通过TLR4途径来诱导内皮细胞炎性反应的发生[9]。然而，ox-LDL诱导内皮细胞的炎性反应中TLR2的作用尚不清楚，未见相关报道研究。
本实验通过分离小鼠心脏内皮细胞，然后使用ox-LDL诱导内皮细胞炎性反应，研究TLR2在ox-LDL诱导内皮细胞慢性炎性反应中的表达变化，有助于进一步了解ox-LDL诱导动脉粥样硬化的机制，为动脉粥样硬化的诊治提供新的思路。
1 材料
1.1 实验动物
C57BL/6小鼠，清洁级，8～10周龄，汕头大学医学院实验动物中心提供（批号0008466）。
1.2 主要试剂
DMEM-F12培养基（11995-065），胎牛血清（SV 30087.01）和胰蛋白酶（25200056，Gibico），ox-LDL（YB-002，广州奕源生物科技有限公司），胶原酶Ⅱ（上海生工生物工程公司），兔抗小鼠TLR2多克隆抗体（sc-10739，Santa Cruz），兔抗小鼠ICAM-1（115-035-003，Jackson Immuno Research），BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型，P0010，中国碧云天公司），IL-6（YY42899）和IL-8（YY42899）ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）。
2 方法
2.1 细胞分离和培养
参照既往方法[3]，取3～4只8～12周雄性C57BL/6小鼠，颈椎分离法处死后，取出心脏组织浸于4℃预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）皿中，将心脏组织剪碎，转移至试管中，加入10 mL胶原酶Ⅱ（0.1%）于37℃水浴锅中消化2次，各10 min，每次均弃掉上清，在试管中加入10 mL胰酶（0.25%），于37℃水浴锅中共消化3次，各10 min，每次取其上清置于事先备好血清的离心管中，1200 r/min离心10 min，往离心所得的细胞团加入含10%FBS的高糖DMEM培养基，混匀，分配等量培养基接种到12孔板上，以后定期换液。
2.2 实验分组
将小鼠心脏内皮细胞随机分为对照组（加入DMEM培养基）和干预组，干预组分别加入低浓度ox-LDL（20 mg/L）和高浓度ox-LDL（40 mg/L）作为低浓度组和高浓度组，各组重复实验5次。
2.3 Western blot法测定ICAM-1、TLR2蛋白表达
细胞用4℃预冷的PBS洗3次，每孔细胞加入30 μL RIPA裂解液，置冰上30 min后，刮下细胞，12 000 r/min离心10 min，上清即为总的细胞蛋白溶解成分。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）测定蛋白浓度，加入样品缓冲液后煮沸10 min变性。按常规方法行SDS-PAGE，分离胶为8%，浓缩胶为5%，250 mA转膜（经甲醇处理的PVDF膜），5%脱脂奶粉室温封闭1 h后.置于兔抗鼠一抗（封闭液1∶200稀释）中，4℃孵育过夜，TBS-T洗3次，每次10 min。置于生物素标记的羊抗兔二抗（封闭液1∶5 000稀释）中，室温孵育1.5 h，TBS-T洗3次，每次10 min。使用化学发光试剂盒发光，Quantity One软件分析目的条带的灰度值。
2.4 ELISA法测定IL-6和IL-8水平
按照ELISA试剂盒说明书操作，测定培养基中IL-6和IL-8的表达。
2.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 ox-LDL对小鼠心脏血管内皮细胞ICAM-1、IL-6和IL-8水平的影响
实验结果显示，低浓度组和高浓度组ICAM-1、IL-6和IL-8表达较对照组均明显增加，差异具有统计学意义（P < 0.05）；而高、低浓度组间ICAM-1、IL-6和IL-8表达差异无统计学意义（P > 0.05）（图1、表1）。该结果说明ox-LDL成功诱导了小鼠心脏微血管内皮细胞炎性反应。
A
B
A：ox-LDL诱导小鼠心脏微血管内皮细胞炎性反应中ICAM-1蛋白表达；B：ICAM-1蛋白表达的灰度值与β-actin 比值的变化；与对照组比较，*P < 0.01，与低浓度组比较，#P > 0.05
图1 ox-LDL对小鼠心脏血管内皮细胞炎症因子ICAM-1的影响
表1 ox-LDL对小鼠心脏微血管内皮细胞炎症因子IL-6、IL-8浓度的影响（ng/L，x±s，n=5）
注：与对照组比较，*P < 0.05，与低浓度组比较，#P > 0.05；IL-6：白细胞介素-6；IL-8：白细胞介素-8
3.2 TLR2在ox-LDL诱导的小鼠心脏血管内皮细胞慢性炎性反应中表达变化
本实验使用两种浓度ox-LDL干预小鼠心脏微血管内皮细胞，用Western blot法检测TLR2受体表达的变化。实验结果发现，高、低浓度组的TLR2蛋白表达均较对照组减弱，高浓度组较低浓度组减弱，各组间差异均有高度统计学意义（P < 0.01）（图2）。
A
B
A：ox-LDL诱导小鼠心脏微血管内皮细胞炎性反应中TLR2蛋白表达；B：TLR2蛋白表达灰度值与β-actin比值的变化；与对照组比较，*P < 0.01，与低浓度组比较，#P < 0.01
图2 TLR2在ox-LDL诱导的小鼠心脏血管内皮细胞慢性炎症反应中表达变化
4 讨论
ox-LDL作为重要的致动脉粥样硬化蛋白，已被证实可以通过激活各种炎症因子（包括细胞黏附因子、血管黏附因子、趋化性细胞因子、肿瘤坏死因子等），最终诱导内皮细胞慢性炎性反应的发生。本实验结果显示，与对照组相比，高、低浓度组炎症因子ICAM-1、IL-6和IL-8表达明显升高，但是高、低浓度组间差异无统计学意义。该结果提示，ox-LDL成功诱导了内皮细胞炎性反应，但是高浓度组和低浓度组炎症反应差异小，猜测可能是由于ox-LDL干预浓度40 mg/L时已饱和，因而无法进一步促进相关炎症因子的产生。当然，如果使用更高浓度的ox-LDL进行检验，就可以证实猜测，下一步本课题组拟对此进行研究。
TLR2作为一种炎症受体，已被证实参与动脉粥样硬化的形成，并在其启动和发展中起着重要作用。冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的单核细胞TLR2表达明显上升[10]。TLR2很可能参与ox-LDL诱导的内皮细胞炎性反应，本实验主要探讨TLR2在不同浓度ox-LDL诱导内皮细胞炎性反应中表达变化，结果提示随着ox-LDL浓度升高，TLR2表达呈递减趋势。与此类似的有ox-LDL的另外一个主要受体LOX-1，ox-LDL干预超过一定浓度时，LOX-1受体出现表达不变甚至呈下降趋势[11]。
本研究结果发现，TLR2的表达与LOX-1类似，在ox-LDL诱导的内皮细胞炎性反应中，TLR2呈抑制状态，且呈浓度依赖型。这可能是因为：①ox-LDL抑制TLR2与IL-1同源基因的表达，从而导致TLR2蛋白表达减少。TLR2属于1型跨膜糖蛋白，胞浆区与人类哺乳动物IL-1的胞浆区高度同源，该区域称为TLR-白介素-1受体区域[12]。研究表明，在巨噬细胞中ox-LDL抑制IL-1基因的转录，从而抑制IL-1蛋白的表达[13]。因此，本实验出现TLR2抑制状态可能是因为ox-LDL抑制TLR2与IL-1高度同源基因的表达，从而导致TLR2蛋白表达减少。②在ox-LDL的刺激下，TLR4表达明显增加，基于机体保护作用，TLR2出现表达减少从而缓冲过度炎性反应带来的损伤。相关研究表明，TLR2和TLR4存在交叉作用，两者存在着共同的配体和信号通路，诱导一系列炎性反应的发生[14]。在高脂饮食条件下，TLR2和TLR4共同促进动脉粥样硬化的发展，但是只有TLR2或TLR4在动脉粥样硬化发展中作用不大[15]。使用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）干预不稳定型心绞痛患者的单核细胞后，TLR4表达明显升高，基于机体保护作用，TLR2表达反而减少从而缓解过度炎性反应的发生[16]。虽然本实验中TLR2在ox-LDL诱导的内皮细胞炎性反应中表达减少，但是相当部分研究表明在动脉粥样硬化过程中TLR2表达呈上调状态，因此，关于TLR2在ox-LDL诱导的内皮细胞炎性反应的表达变化尚不明确，仍需进一步的研究。
综上所述，本实验表明ox-LDL在诱导炎性反应的同时，TLR2的表达减少，说明TLR2可能参与ox-LDL诱导的内皮细胞炎性反应，有助于进一步认识ox-LDL诱导动脉粥样硬化的机制，为抑制ox-LDL的研究打下良好的基础，但是关于TLR2在该过程的利弊作用尚不明确。本实验仅从蛋白水平探讨ox-LDL干预后内皮细胞炎性反应，缺乏细胞水平探讨ox-LDL诱导的内皮细胞慢性炎性反应过程中细胞数目形态的变化。再者，本实验无法明确说明TLR2参与ox-LDL诱导的内皮细胞炎性反应的具体下游信号通路，并且无法排除TLR2是通过其他途径起作用，与其他ox-LDL受体之间是否有作用也不清楚。目前关于ox-LDL-TLR2途径在内皮细胞炎性反应中的作用机制仍不明确，需要进一步的探讨。
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（收稿日期：2013-09-29 本文编辑：程 铭）
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