[摘要] 目的 探讨咬合创伤早期大鼠下颌牙槽骨骨组织内细胞间的信息传递情况。方法 通过在左侧上颌第一磨牙粘接钢丝建立大鼠咬合创伤实验动物模型，24 h后局麻下分离大鼠双侧下颌牙槽骨组织，提取总RNA，进行包括27 000个基因的全功能组表达谱基因芯片检测，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对芯片结果进行验证，对差异表达基因进行Pathway分析，找出细胞通讯相关通路。结果 芯片结果显示，差异基因共有586个，Pathway分析涉及106个不同的信号通路，其中主要涉及包括细胞间黏附分子、黏着连接、缝隙连接、焦点粘连及紧密连接在内的5个细胞间通讯相关通路，且5个通路中主要骨代谢相关细胞因子表达均显著下调。结论 咬合创伤早期大鼠牙槽骨组织内细胞间通讯受到抑制。
[关键词] 咬合创伤； 细胞间通讯； 缝隙连接； 焦点粘连； 紧密连接； 黏着连接
[中图分类号] Q 257 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.05.007
The intercellular communication condition of alveolar bone with traumatic occlusion at early stage in rats Wan Haoyuan1，2, Sun Huiqiang1，3, Shang Sixia1, Liu Di1，3, Li Xin1. （1. Dept. of Prosthodontics, Stomatological Hos-pital of Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Dept. of Stomatology, The Third Affiliated Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400042, China; 3. Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedicine, Jinan 250012, China）
[Abstract] Objective To study the intercellular communication of alveolar bone during traumatic occlusion at early stage in rats. Methods The occlusal surface of the upper left first molar of rat was raised by placing a stainless steel wire to induce occlusal trauma in the lower left first molar. After 24 hours, the alveolar bone tissues of the lower jaws first molars at the both sides were taken out under anesthesia. The various 27 000 genes were identified with genome-wide microarray, and further were investigated with reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） and Path-way analysis. Results Total 586 gene were found to be changed, 106 different signal pathways got involved with Path-way analysis, including cell adhesion molecules（CAMS）, adhesions junction, gap junction, focal adhesion and tight junc-tion, and the cytokines associated with bone metabolism in above 5 signal pathways were all down-regulated. Conclusion At the early phase of the occlusal trauma, intercellular communication in rat’s alveolar bone were inhibited.
[Key words] traumatic occlusion； intercellular communication； gap junction； focal adhesion； tight junction；
adhesions junction
咬合创伤是由于咬合关系不正常或咬合力量不协调，个别或某几个牙所受的咬合力量超过其牙周组织的耐受力而造成的牙周组织损伤情况，可引起牙槽骨的吸收。导致咬合创伤的常见因素有错畸形、早接触、干扰等。骨吸收是一个复杂的生物学过程，该过程中骨组织细胞间的通讯发挥重要的作用[1]，细胞间通过直接或间接信息传递，形成复杂
的通讯网络，对此通讯网络的研究将有利于进一步明确骨吸收的分子生物学机制。本实验采用人为咬合升高法建立大鼠咬合创伤模型，对咬合创伤导致牙槽骨吸收早期过程中骨组织细胞间的信息传递进行通路分析，希望进一步明确该生物过程中的细胞通讯情况。
1 材料和方法
1.1 实验动物、主要试剂和仪器
SD大鼠（山东大学实验动物中心），咬合升高粘
接复合树脂（3M公司，德国），麻醉用40 mL·kg-1水
合氯醛（山东大学齐鲁医院制剂室），Trizol（Invitri-gen公司，美国），聚合酶链反应（polymerase chain
reaction，PCR）试剂盒、DNA聚合酶和dNTP（MBI公司，立陶宛），引物（上海生物工程有限公司），27 K
Rat Genome Array芯片的Oligo DNA参自Oligo库（Ope-ron公司，美国），NucleoSpin Extract Ⅱ Kit（Mache-rey-Nagel公司，德国），LuxScan 10 KA双通道激光扫描仪（北京CapitalBio公司），GenePix Pm 4.0图像
分析软件（Axon Instruments公司，美国）。
1.2 动物模型的建立
选用（280±20） g雄性SD大鼠5只为研究对象，腹腔内注射水合氯醛，剂量为100 mg·kg-1。麻醉状态下在大鼠左侧上颌第一磨牙咬合面上粘接厚度为1 mm的方丝，用Super-bond复合树脂堆积法粘接，形成同侧下颌第一磨牙的咬合创伤模型。左侧下颌第一磨牙处牙槽骨作为实验侧，同一只大鼠对侧下颌第一磨牙处牙槽骨为对照侧。常规饮食，24 h后腹腔注射水合氯醛，拔除双侧第一磨牙，刮净牙槽窝内牙周膜，取大鼠双侧牙槽骨组织放入液氮中备用。
1.3 总RNA的提取
按TrizolTMNA Isolation Reagent流程提取所取大鼠牙槽骨中总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，进一步对总RNA行过柱纯化，最后用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。
1.4 探针标记与杂交
取实验侧和对照侧牙槽骨组织总RNA各50 μg逆转录合成cDNA，将cDNA用KLENOW酶标记：Cy3-dCTP标记实验侧cDNA，Cy5-dCTP标记对照侧cDNA，标记产物用NucleoSpin Extract Ⅱ Kit纯化，纯化后抽干。
1.5 芯片制备和杂交
将标记的DNA溶于30 μL杂交液中，42 ℃下杂交过夜。杂交结束后，42 ℃下在含0.2％十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、2×SSC的液体中洗涤5 min，再在0.2×SSC中室温洗涤5 min，将玻片甩干，用LuxScan 10 KA双通道激光扫描仪扫描。
1.6 差异基因的检测与分析
生物信息学分析Cy3、Cy5荧光强度，计算Cy5/Cy3值。Cy5/Cy3>1.5，基因表达增高，Cy5/Cy3<0.667，基因表达降低；并对差异表达基因进行Pathway分析，筛选与通讯相关的通路。
1.7 芯片结果的验证
选取芯片结果中表达显著差异的3个因子采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase
chain reaction，RT-PCR）技术观察表达改变情况，
对芯片结果进行RT-PCR验证。
2 结果
2.1 总RNA的提取
电泳检测RNA带显示：28S、18S条带清晰（图1），紫外分光光度计检测A260 nm/A280 nm为1.8～2.0。表明RNA质量较好，符合实验要求。
1：实验侧牙槽骨；2：对照侧牙槽骨；3：Marker。
图 1 RNA样品检测结果
Fig 1 The analysis of the RNA levels
2.2 芯片杂交
采用LuxScan 10 KA双通道激光扫描仪扫描实验结果荧光信号，以对数散点图形式表示，图中红色点表示实验侧表达显著升高的细胞因子；黑色点表示表达没有明显改变的细胞因子；绿色点表示表达显著降低的细胞因子，结果显示本实验存在大量表达显著改变的细胞因子（图2）。
图 2 实验结果荧光信号对数散点图
Fig 2 Logarithm scatter diagram about fluorescent signal of the
experiment results
图2中x轴和y轴分别以对照侧和实验侧的荧光信号强度值为坐标，图中每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号。红色标记的数据点表示实验侧/对照侧的Ratio值≥1.5，表示该基因点实验侧与对照侧相比表达有显著增高；绿色标记的数据点表
示实验侧/对照侧的Ratio值≤0.667，表示该基因点实验侧与对照组相比表达显著降低；黑色标记表示实验侧/对照侧的Ratio值为0.667～1.5，表达基本无差异。
2.3 芯片结果分析
实验侧及对照侧表达差异基因共有586个，芯片结果Pathway分析涉及106个不同的信号通路，通讯相关通路涉及细胞间黏附分子（cell adhesion mole-
cules，CAMs）、黏着连接（adhesions junction）、缝
隙连接（gap junction）、焦点粘连（focal adhesion）以及紧密连接（tight junction）通路，各通路涉及细胞因子大部分显著下调（表1）。
2.4 RT-PCR验证结果
为了验证芯片结果的可靠性，在实验结果中选择有代表性的、表达显著改变且与成骨相关的Bglap、Alp1及Wnt4因子设计引物（表2）。以Actin为内参（正向引物序列：5’-GTACCCAGGCATTGCTGACA-3’，反向引物序列：5’-CTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3’）。然后进行RT-PCR实验，具体见电泳图（图3），结果可见RT-PCR反应特异性都很好，实验结果与芯片结果一致，进一步验证了本实验结果的可靠性。
1～2、3～4、5～6、7～8分别为以样品的1st-cDNA为模板，RT-PCR扩增Actin、Bglap、Alp1、Wnt4基因；Marker：TaKaRa DL2000。
图 3 验证结果电泳图
Fig 3 The testing results of electrophoresis
3 讨论
咬合创伤作为一种病理性损伤可以造成牙周组织的适应性改变，导致牙槽骨吸收。本实验采用在大鼠左侧上颌第一磨牙咬合面上强力粘接复合树脂，内置方丝，使该牙咬合升高1 mm，形成同侧下颌第一磨牙的咬合创伤模型。
骨代谢是一个骨吸收与骨形成动态的过程。骨细胞、成骨细胞、破骨细胞间的相互识别及信息传递对于细胞的增殖、分化及活性都有十分重要的作用，它们之间的相互通讯主要是由CAMs及黏着连接、缝隙连接、焦点粘连、紧密连接等完成的[1]。CAMs是参与细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间相互作用的分子；细胞黏附指细胞间的黏附，是细胞间信息交流的一种形式。本实验结果显示：与对照侧相比，实验侧细胞间黏附分子F11受体（F11r）、多
配体聚糖1（Sdc1）、封闭蛋白1（Cldn1）、脊髓灰质炎病毒受体相关分子3（Pvrl3）、封闭蛋白10（Cldn10）等均显著下调，细胞间信息交流受到抑制。成骨细胞间信息传递主要通过黏着连接，黏着连接作为一种细胞间结构允许同形、钙依赖性细胞之间通过钙黏着蛋白相互黏附[2]。研究发现：钙黏着蛋白在骨形成过程中也发挥重要作用，它在骨形成的不同阶段，钙黏着蛋白表达不同的亚型[3]。研究表明钙黏着蛋白
主要通过调节Wnt/β-catenin通路来影响骨发生性基质干细胞的发生[2]。实验结果中钙黏着蛋白相关蛋白α1（Ctnnα1）显著下调，同时黏着连接相关蛋白辅肌动蛋白4（Actn4）、Pvrl3等均显著下调，黏着连接信号传导
受到明显抑制，与此同时，芯片结果Pathway分析显示本实验中Wnt/β-catenin通路也受到明显抑制。研究表明：细胞外基质如角聚糖（Keratocan）对于成骨细胞的分化和成熟都有十分重要的作用，并且可通过影响成骨细胞来对破骨细胞的分化和成熟产生影响[4]，焦点粘连在此过程中发挥重要的作用。Boutahar等[5]研究表明机械刺激能够促进成骨细胞焦点粘接激酶（focal-adhesion kinase，FAK）自磷酸化，从而改变其活性。研究表明FAK能够通过核心结合因子α1、β1-整合素刺激成骨细胞及成熟破骨细胞的细胞间黏附分子和核因子κB受体活化因子配体表达来影响其分化和活性[6]。本实验中实验侧牙槽骨细胞间焦点连接主
要蛋白Ⅰ型胶原α1（Col1α1）、Ⅰ型胶原α2（Col1α2）
等均显著下调，焦点连接信号传导受到明显抑制。缝隙连接是一种特殊的蛋白通道，在骨吸收和形成的各个阶段均发挥着重要的调控作用[7]。研究证明：缝
隙连接对成骨细胞、破骨细胞的分化、活性均发挥着不可替代的作用[8]。此外，缝隙连接还可以将机械刺激的感受细胞——骨细胞感受到的机械刺激转化为调节骨形成和吸收的生物信号传递到骨表面影响成骨细胞及破骨细胞的活动[9]，间接调控骨的形成和吸收，它所介导的信号转导为骨骼细胞间信息的传递提供了一条便捷的途径，实验结果显示实验侧牙槽骨细胞缝隙连接蛋白α1（Gjα1）显著下调，牙槽骨细胞间缝隙连接信号传导受到抑制。紧密连接是上皮细胞顶端侧面质膜中的封闭蛋白和密封蛋白在细胞间构成的密封连接，两膜之间不留空隙，使胞外物质不能通过。成骨细胞能够表达紧密连接相关蛋白[10]，成骨细胞和骨细胞在体内和体外都能够通过形成紧密连接[11]，调节细胞内及细胞外基质K+和Ca2+的浓度来影响骨改建和矿化[12]，本实验中实验侧牙槽骨细胞
紧密连接蛋白Cldn1、Cldn10等均显著下调，细胞间紧密连接信号传导受到抑制。此外，本实验中出现了5个表达上调的细胞因子，分别为Mylpf、Rap1b、Actn2、Ptpn6、Tubα3a。以往研究尚未发现Mylpf、Rap1b、Actn2、Tubα3a与骨代谢相关，其表达上调可能原因是这4个细胞因子出现在其他组织代谢过程中，也受到咬合创伤所带来的炎性反应的影响，但与骨代谢不相关。Babij等[13]研究发现Ptpn6表达上调会导致骨量丢失，本实验结果与此研究一致。骨细胞、成骨细胞、破骨细胞及细胞外基质通过各种连接方式来传递信息，共同维持骨代谢的平衡，其分子生物学机制较为复杂，目前对骨组织中通讯系统的研究是一大热点，具体机制还有待进一步研究。
本实验采用咬合升高法建立大鼠咬合创伤模型，采用包括27 000个基因的全功能组表达谱基因芯片检测咬合创伤导致牙槽骨组织内差异表达因子，并对实验结果进行Pathway分析。本实验结果显示咬合创伤模型牙槽骨组织通讯相关信号通路内差异表达因子涉及CAMs、黏着连接、缝隙连接、焦点粘连以及紧密连接等细胞间信息传递通路，且这些通路中与骨代谢相关的主要细胞因子表达均显著下调。研究结果初步表明，在咬合创伤24 h时，大鼠牙槽骨细胞间通讯普遍受到抑制。
[参考文献]
[1]Nakahama K. Cellular communications in bone homeostasis and
repair[J]. Cell Mol Life Sci, 2010, 67（23）：4001-4009.
[2]Nelson WJ, Nusse R. Convergence of Wnt, beta-catenin, and cad-
herin pathways[J]. Science, 2004, 303（5663）：1483-1487.
[3]Di Benedetto A, Watkins M, Grimston S, et al. N-cadherin and
cadherin 11 modulate postnatal bone growth and osteoblast diffe-
rentiation by distinct mechanisms[J]. J Cell Sci, 2010, 123（Pt 15）：
2640-2648.
[4]Igwe JC, Gao Q, Kizivat T, et al. Keratocan is expressed by osteo-
blasts and can modulate osteogenic differentiation[J]. Connect Tis-
sue Res, 2011, 52（5）：401-407.
[5]Boutahar N, Guignandon A, Vico L, et al. Mechanical strain on
osteoblasts activates autophosphorylation of focal adhesion kinase
and proline-rich tyrosine kinase 2 tyrosine sites involved in ERK
activation[J]. J Biol Chem, 2004, 279（29）：30588-30599.
[6]Schneider GB, Zaharias R, Seabold D, et al. Integrin-associated
tyrosine kinase FAK affects Cbfα1 expression[J]. J Orthop Res,
2011, 29（9）：1443-1447.
[7]Stains JP, Civitelli R. Gap junctions in skeletal development and
function[J]. Biochim Biophys Acta, 2005, 1719（1/2）：69-81.
[8]Schilling AF, Filke S, Lange T, et al. Gap junctional communica-
tion in human osteoclasts in vitro and in vivo[J]. J Cell Mol Med,
2008, 12（6A）：2497-2504.
[9]Taylor AF, Saunders MM, Shingle DL, et al. Mechanically stimu-
lated osteocytes regulate osteoblastic activity via gap junctions[J].
Am J Physiol Cell Physiol, 2007, 292（1）：C545-C552.
[10] Wongdee K, Pandaranandaka J, Teerapornpuntakit J, et al. Osteo-
blasts express claudins and tight junction-associated proteins[J].
Histochem Cell Biol, 2008, 130（1）：79-90.
[11] Wongdee K, Riengrojpitak S, Krishnamra N, et al. Claudin ex-
pression in the bone-lining cells of female rats exposed to long-
standing acidemia[J]. Exp Mol Pathol, 2010, 88（2）：305-310.
[12] Marenzana M, Shipley AM, Squitiero P, et al. Bone as an ion ex-
change organ： Evidence for instantaneous cell-dependent calcium
efflux from bone not due to resorption[J]. Bone, 2005, 37（4）：545-
554.
[13] Babij P, Roudier M, Graves T, et al. New variants in the Enpp1
and Ptpn6 genes cause low BMD, crystal-related arthropathy, and
vascular calcification[J]. J Bone Miner Res, 2009, 24（9）：1552-
1564.
（本文编辑 杜冰）
推荐访问： 咬合 创伤 大鼠 细胞 状况
