MAPK信号通路在高糖高脂诱导的心肌细胞肥大中的差异调节作用

材料与方法

1.1 材料 大鼠胚胎心肌细胞H9c2（北纳创联生物技术研究院，北京）；DMEM高糖培养基、青链霉素混合液、PBS缓冲液、0.25%胰蛋白酶（博士德生物工程有限公司，武汉）；胎牛血清（Gibco公司，美国）；葡萄糖D-GLUCOSE（索莱宝生物科技有限公司，北京）；棕榈酸钠Sodium palmitate（Sigma，美国）；乳酸脱氢酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京）；Trizol总RNA提取试剂、RT-PCR测定试剂盒、RNA引物合成（TaKaRa，日本）；无RNA酶枪尖、氯仿、乙醇、DEPC、八联管等（生工生物工程股份有限公司，上海）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，上海）；单克隆兔抗p-JNK、p-p38、t-p38抗体、多克隆兔抗p-ERK、t-JNK、t-ERK（CST公司，美国）；辣根过氧化物酶标记的二抗（中杉金桥生物技术有限公司，北京）；Western blotting 发光液（爱必信生物科技有限公司，上海）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 H9c2心肌细胞来源于大鼠胚胎期心脏组织，接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，将其置于5% CO2、37 ℃孵箱进行培养，待细胞生长至70%～80%进行实验干预。实验分为4组：正常对照组，高糖高脂A组（33 mmol/L葡萄糖+250 µmol/L棕榈酸钠），高糖高脂B组（33 mmol/L葡萄糖+500 µmol/L棕榈酸钠），高糖高脂C组（33 mmol/L葡萄糖+1000 µmol/L棕榈酸钠）。

1.2.2 乳酸脱氢酶测定试剂盒检测LDH的活性 于六孔板中种植H9c2心肌细胞，待细胞融合度达到70%～80%时，按照分组给予不同处理后，在不同时间收集。操作流程根据试剂盒说明书进行，操作结束后用酶标仪测定各孔450 nm处的吸光度值计算其活力。

1.2.3 Real-time PCR检测ANP、α-SKA的mRNA的表达 按照Trizol说明书步骤提取细胞总RNA，采用分光光度计检测RNA样品的A260/A280比值在1.8～2.0，以确定RNA纯度，并计算出RNA的浓度。参照RT-PCR试剂盒说明书进行反转录，将反转录管放于PCR仪中进行逆转录反应，逆转录反应参数：37 ℃ 15 min（反转录反应），85 ℃ 5 s（反转录酶的失活反应），4 ℃。两步法进行PCR扩增反应，RT-PCR扩增的引物序列（表1），按照说明书加入SYBR荧光染料、引物序列以及反转录后的产物，在Mx 3000p荧光定量PCR仪（Stratagene） 上进行，扩增反应参数为：预变性：95 ℃，30 s，1个循环；PCR反应：95 ℃ 5 s、60 ℃ 30～34 s，40个循环。每组样品设置3个复孔以保证实验结果的有效性、重复性和准确性。

1.2.4 Western blot检测高糖高脂干预H9c2心肌细胞24 hp-ERK、p-JNK、p-p38的蛋白表达量 H9c2心肌细胞接种于六孔板中，培养至70%～80%满时分为两组：正常对照组和高糖高脂B组，给予不同的处理，然后待处理时间为24 h时弃去培养液，用预冷的PBS洗两次，加入配好的裂解液进行裂解并收集于离心管中进行超声破碎和离心。然后用BCA法测定蛋白浓度调整相应的上样量制备好蛋白样本。95 ℃煮5 min变性，制备12%SDS分离胶和5%浓缩胶进行电泳从而分离蛋白质，电泳结束后使用半干转将已分离的蛋白质转印至PVDF膜上，然后再用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。封闭结束后用TBST洗膜3次，5 min/次，將膜置于相应的一抗稀释液（1∶1000）中4 ℃摇床过夜。次日取出膜用TBST洗膜3次，5 min/次，将膜置二抗稀释液（1∶10 000）中于摇床上室温孵育1 h，洗膜后即可进行ECL发光法显影。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行数据的分析处理，计量资料采用（x±s）表示，先进行数据的正态性检验、方差齐性检验，符合上述条件者行单因素方差分析比较多组间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间对H9c2细胞中LDH活力的影响 高糖高脂处理H9c2，细胞上清LDH的活性呈浓度及时间依赖性，随着浓度和时间的逐渐增加，上清LDH的活性与高糖高脂处理间呈浓度及时间依赖性（P<0.05），见表2。

2.2 高糖高脂可增加H9c2细胞中ANP mRNA水平的表达 随着浓度和时间的逐渐增加，ANP的表达也逐渐升高，且在高糖高脂B组（33 mmol/L葡萄糖+500 µmol/L棕榈酸钠）干预细胞36 h时ANP表达量达到高峰（P<0.01）。见表3。

2.3 高糖高脂促进α-SKA mRNA的表达 相比对照组而言，高糖高脂促进α-SKA 的表达，且在36 h高糖高脂B组其表达达到最高（P<0.05），这与ANP的结果一致，据此确定高糖中浓度脂干预细胞36 h为干预浓度和时间，见表4。

2.4 高糖高脂可诱导MAPK蛋白磷酸化 相比对照组，高糖高脂B组干预24 h MAPK家族成员p38、ERK、JNK磷酸化水平均增高，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。其中p-ERK的活化水平增加了约1.39倍（0.96±0.16 vs 0.69±0.04），p-JNK的活化水平增加了约1.47倍（1.05±0.21 vs 0.78±0.09），而p-p38的活化水平相对于对照组增加了约3.34倍（2.35±0.35 vs 0.71±0.14），见图1。

3 讨论

糖尿病心肌病是在1972年由Rubler等首先提出的，糖尿病心肌病的定义为有明确糖尿病病史，同时有明确的心肌结构和功能改变，排除缺血性疾病、高血压及其他可能引起心肌病变的疾病[11-13]。本实验通过离体实验用高糖高脂将正常心肌细胞处理作为体外糖尿病心肌病模型，证实：高糖高脂可诱发心肌肥大，进而导致心肌结构改变；在心肌肥大的发生及发展过程中MAPK信号家族具有重要作用。

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素、生活方式等各种原因导致机体持续高血糖高血脂以及长期代谢紊乱综合征[14-15]。高糖高脂持续状态下，细胞外基质大量增生、胶原降解异常以及心肌间质纤维化，纤维化的增加直接促进成纤维细胞增殖，导致心肌肥大和重构，心脏功能受限[16]。目前已有研究利用高糖及不同浓度高脂干预H9c2心肌细胞建立糖尿病心肌病模型，通过检测特异性基因A型心房钠尿肽（ANP）和α-心肌肌动蛋白（α-SKA）来确定模型的建立成功[17]。据此笔者采用高糖（33 mmol/L）

及不同浓度高脂（250、500、1000 µmol/L）干预细胞，从而检测ANP、α-SKA的表达。相比对照组，高糖高脂显著增加ANP和α-SKA的mRNA表达，在高糖高脂（33 mmol/L+500 µmol/L）36 h时ANP、α-SKA的mRNA表达最高，因此成功建造了体外糖尿病心肌病模型。

MAPK主要有3个亚组：细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2）、p38、c-Jun氨基端激酶/应激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase，JNK/SAPK）。每条信号通路都具有高度特异性，具有独立的功能，在某些程度上几条信号通路间存在着一定的关联，很多刺激因素如缺血、缺氧、激素、细胞因子、细胞应激等各种细胞外刺激均可诱导其激活，从而成为细胞增殖、分化、凋亡等与生理过程密切相关的核反应共同通路或汇聚点[18]。有研究已表明ERK主要参与介导细胞的生长、分化、发育、增殖等生理病理过程；而p38和JNK则与细胞炎症、凋亡、生长、分化、应激反应等过程有关[19-20]。在此实验中，笔者检测到在糖尿病心肌病的发生发展过程中ERK、JNK、p38均被激活，且p38的活化水平增加最显著。这提示笔者p38主导凋亡过程同时伴随ERK活化而促进细胞增生的现象很有可能是引起DCM发生发展过程中的重要环节。但细胞内的信号通路是一个复杂的网络系统，是否有其他通路在DCM的发展过程中发挥作用还需通过大量研究来进一步说明。

综上所述，笔者通过探讨MAPK在由高糖高脂诱导的H9c2心肌细胞肥厚过程中的作用，揭示以凋亡信号为主导的细胞凋亡通路及增生通路并存在其中扮演重要角色，从而在机理方面为DCM的治疗提供新的思路，最终为糖尿病心肌病的预后提供新的靶点。

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