材料与方法
1.1ACC基因的鉴定
油棕的全基因组序列从NCBI（the National Center for Biotechnology Information）网站上下载，拟南芥的ACC基因从TAIR（the Arabidopsis Information Resource）网站上下载，为了鉴定油棕的ACC基因，将拟南芥ACC蛋白质序列与油棕的蛋白质数据库进行Blastp比对，比对的E值的阈值为1e-10，将预测的油棕ACC蛋白质序列与CDD （http：//www.ncbi.nlm.gov.cdd）和PFAM数据库（http：//pfam.sanger.ac.uk）进行比对。
1.2ACC基因结构分析
油棕基因组的注释结果从NCBI（the National Center for Biotechnology Information）网站上下载，ACC基因结构采用GSDS（the Gene Structure Display Server Programme）软件进行展示。
1.3ACC基因的表达分析
油棕的32个转录组的原始reads数据从NCBI网站的SRA数据库（Sequence Read Archive）中下载，这些转录组分别来自于油棕的中果皮、叶子、果、花、根和茎。为了检测ACC基因在油棕不同组织中的表达，对AAC基因RPKM值进行计算，计算公式如下：
RPKM= 106CNL/103
在该公式中，C代表比对在某一个表达基因序列上的reads的条数，N代表比对上所有表达序列的总reads数，L代表对应的基因序列的长度[6]。
2结果与分析
2.1油棕ACC基因的鉴定从TAIR网站挖掘ACC基因，有2个基因为丙二酰CoA（ACC），分别为At1g36160和At1g36180。用拟南芥的这2个基因的蛋白质序列与油棕的蛋白质库进行Blastp，设定阈值为1e-10。在油棕的基因组上，发现了2个同源基因，其中1个EgACC基因位于油棕第3染色体上， 而另外1个EgACC基因未能定在油棕的染色体上。这2个EgACC基因的长度分别为1 164和18 256 bp。序列长度较短的ACC基因命名为EgACC1，而序列较长的ACC基因命名为EgACC2。
2.2EgACC基因的结构分析这2个基因的结构，结果显示EgACC1并不含有内含子，总基因的长度为1 164 bp，而EgACC2含有32个内含子，外显子最短的只有40 bp，而最长的外显子有2 157 bp，平均每个外显子222.75 bp。
2.3不同物种ACC基因的聚类分析下载拟南芥、油菜、油茶、花生、玉米、大豆以及油棕ACC基因的蛋白质序列，并采用Joining Neighbour的方法，对这些蛋白质序列进行聚类，聚类结构显示：拟南芥、油茶、玉米、油茶的ACC基因聚在一块，而油棕的ACC2和大豆的ACC2基因聚在一块，花生的ACC与大豆ACC1基因聚在一块，而油棕的ACC1被单独地聚在一类。ACC2基因在所有组织中都检测到表达量。
2.4油棕ACC基因在不同组织中的表达
下载油棕的32个转录组的数据，这些转录组分别来自于油棕发育不同时期的中果皮、根、茎、叶、花、果。依据这些转录组的原始数据计算RPKM值，油棕的ACC1基因在所有组织中都没有表达，而ACC2在不同的组织都有表达量，ACC2基因在油棕的组培苗中有高的表达量，同时在油棕果发育21 d时有高的表达水平，RPKM值为70.6，为所有组织中最高。
3讨论
油棕是一种重要热带油料作物，因产油量高，而被称为“世界油王”。油棕的基因组已被测序，测序结果显示：油棕基因组为1.53 Gb，预测了34 802个基因，在该研究中，应用拟南芥ACC蛋白质序列比对油棕的蛋白质库，并鉴定2个油棕的ACC基因，分别命名为EgACC1和EgACC2。对这2个ACC的基因结构进行分析，分析结果显示：EgACC1不含内含子，而EgACC2含有32个内含子，同时，研究了这2个EgACC基因在油棕组培苗以及不同组织中的表达，同时也研究这2个ACC基因在油棕中果皮发育不同时期的表达变化，结果显示：EgACC1在所有组织中都没有表达，而EgACC2在所有组织中都有表达，该基因在组培苗中有较高的表达量，同时，在油棕果发育21 d有高的表达水平，RPKM值为70.6，为所有组织中最高。
在脂类代谢的研究中，拟南芥是重要的模式植物，目前已研究了该物种中包括脂肪酸从头合成，三酰基甘油合成和脂肪酸三酰基甘油降解等23条代谢途径，脂肪酸合成的前体为乙酰CoA，它首先在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA，然后脂肪酸合成酶復合物（fatty acid synthetase complex，FAS）以丙二酸单酰CoA为底物进行聚合反应，以每次循环2个碳的频率合成酰基碳链[7]。而不断地增加酰基碳链与酰基载体蛋白结合，以保护其不受代谢途径中多种酶的侵蚀。一些研究已表明：FAS常为酮酯酰基ACP合成酶，多次反应加碳后，脂肪酸可以在酰基ACP硫酯酶（acyl-ACP thioesterase）或酰基转移酶（acyltransferase）的作用下终止。
ACC酶有2种形式，即多功能酶和多酶复合体，前者被称为真核形式的ACC，而后者被称为原核形式的ACC，原核形式的ACC可以被分为几个多功能的亚基，即生物羧化酶、生物素羧基载体蛋白、羧基转移酶和另一个未知功能的蛋白。在单子叶作物（ 如小麦、玉米和水稻）中的ACC酶为真核形式，这些ACC酶对aryloxy phenoxy propionates和cyclo hexane diones这2种除草剂非常敏感。但是在双子叶植物豌豆和烟草中，ACC为原核形式。Gengenbach等[8]检测了ACC基因在高油黄豆和低油黄豆中的表达量，结果显示，在高油黄豆中ACC基因的表达量是低油黄豆的2倍，特别是在发育的早期和中期，这些结果暗示ACC基因的表达与黄豆脂肪酸的积累具有较高的相关性。Ohlrogge等[9]将油棕种子储藏蛋白的启动子与拟南芥的ACC基因连接，并转化油菜，在T1代，拟南芥的脂肪酸含量增加5.0%～6.4%。Sellwood等[10]通过反义表达技术，抑制ACC基因的表达，转基因植株的含油量显著降低。
参考文献
[1]
BASRI W M，ABDULLAH S N A，HENSON I E.Oil palm：Achievements and potential[J].Plant production science，2005，8（3）：288-297.
[2] KOH L P，WILCOVE D S.Cashing in palm oil for conservation[J].Nature，2007，448：993-994.
[3] 李昌珠，李正茂.植物脂肪酸的生物合成及其生理功能的研究進展[J].湖南林业科技，2009，36（6）：45-49.
[4] ASHTON A R，JENKINS C L D，WHITFIELD P R.Molecular cloning of two different cDNAs for malize acetyl CoA carboxylase[J].Plant Mol Biol，1994，24（1）：35-49.
[5] ALBAN C，BALDET P，DOUCE J.Localization and characterization of two structurally different forms of acetylCoA carboxylase in young pea leaves，of which one is sensitive to aryloxyphenoxy propionate herbicides[J].Biochem J，1994，30：557-565.
[6] MORTAZAVI A，WILLIAMS B A，MCCUE K，et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNASeq[J].Nat Methods，2008，5（7）：621-628.
[7] OHLROGGE J，BROWSE J.Lipid biosynthesis[J].Plant cell，1995，7（7）：957-970.
[8] GENGENBACH B G，SOMERS D A，WYSE D L，et al.Transgenic plants expressing maize acetyl CoA carboxylase gene and method of altering oil content：6222099[P].2001-04-24.
[9] OHLROGGE J B，ROESLER K R，SHORROSH B S.Method of increasing oil content of seeds：5925805[P].1999-07-20.
[10] SELLWOOD C，SLABAS A R，RAWSTHORNE S.Effects of manipulating expression of acetyplCoA carboxylasel in Brassica napus L.embryos[J].Biochemical society，2000，28（6）：598-600.
推荐访问： 油棕 乙酰 基因 鉴定 表达
