材料，在培养基中添加0、1、5 μmol/L浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素（TSA），研究TSA对杨树根再生和生长的影响。结果表明，TSA处理明显抑制2种杨树根的再生和生长，TSA浓度越高，对组培苗根的再生和生长的抑制作用越大。研究结果对于通过根系改良提高杨树对水分和营养物质的利用率、增强杨树抗逆性具有十分重要的意义。
关键词：组蛋白去乙酰化酶（HDAC）；曲古抑菌素（TSA）；根再生；生长
中图分类号： S792.110.5文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）05-0040-04
表观遗传调控是基因表达调控的一种重要方式，是在不改变DNA序列的情况下，通过DNA或组蛋白修饰来影响基因的转录。组蛋白修饰包括组蛋白乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化、糖基化等[1]，其中组蛋白乙酰化是研究得最早、最清楚的一种组蛋白翻译后修饰[2]。组蛋白乙酰化修饰主要发生在组蛋白N末端的赖氨酸残基上，包括组蛋白乙酰化、组蛋白去乙酰化2个动态的、可逆的过程。组蛋白乙酰化能够减弱组蛋白与带负电荷的DNA之间的相互作用，使染色质处于伸展状态[3]；又可以改变核小体的表面结构，形成有利于转录调节因子结合的位点[3-4]，进而对基因的转录具有促进作用。相关研究表明，在转录活化区域内，组蛋白多表现出高度的乙酰化状态。组蛋白去乙酰化常常引起染色质的凝缩，与基因转录抑制或基因沉默有关。组蛋白乙酰化、去乙酰化过程分别由组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferase，简称HAT）、组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，简称HDAC）催化完成，二者共同作用保证细胞内组蛋白乙酰化水平处于动态平衡。HDAC是1个基因超家族，在真核生物包括真菌、植物和动物中广泛分布。1996年第1个HDAC基因从哺乳动物细胞中得到克隆[5]，1988年在豌豆中首次发现植物组蛋白去乙酰化酶的存在[6]。近十几年来，植物HDAC越来[CM（25]越受到重视，HDAC基因从玉米、拟南芥、水稻、大麦、马铃[CM）][LM]薯、葡萄、烟草等多种植物中得以鉴定和分析。根据与酵母HDAC序列同源性比较，这些植物HDAC可分为3个亚家族：RPD3/HDA1、HD2、SIR2，其中HD2是植物所特有的一类组蛋白去乙酰化酶。HDAC在植物生长、发育、胁迫反应和基因沉默过程中具有十分重要的调控作用。
虽然相关报道不多，但在拟南芥等草本植物中的研究表明，HDAC在根系发育（包括根毛发育、侧根形成和主根生长）过程中发挥着十分重要的调节作用。HDAC与根毛发育有密切关系。早在2000年，Murphy等研究发现，HDAC特异性抑制剂如组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素（trichostatin A，简称TSA）、丁酸钠（sodium butyrate）能够抑制豌豆（Pisum sativum）根分生组织细胞的有丝分裂[7]。2005年，Xu等研究发现，TSA处理能够改变根模式形成相关基因[WTBX][STBX]CPC、GL2、WER[WTBZ][STBZ]的表达，并引起根毛细胞在非根毛形成部位的出现和发育[8]。2011年，Zhu等研究发现拟南芥RPD3/HDA1亚家族另一个成员HDA6能够抑制根发育调节因子EIN3（ethylene insensitive 3）所调节基因的表达，并抑制茉莉酸（JA）信号反应；TSA处理会诱导拟南芥幼苗产生大量根毛[9]。拟南芥HDA19也与根毛发育有关，HDA19促进低磷（Pi）条件下根毛的产生[10]。除了调节根毛发育，HDAC对侧根发育也有十分重要的作用。侧根的发育受到生长素以及生长素应答因子（auxin response factor，简称ARF）的调节。HDAC对生长素介导的拟南芥侧根的发育具有负调控作用[11]。在根发育过程中，生长素到达主根根尖需要生长素转运蛋白如PIN（pin-formed）家族、ABC（ATP-binding cassette）超家族的运输[12]。2013年，Nguyen等研究发现，在HDAC抑制剂如TSA、NaB存在下，PIN1蛋白被26S蛋白酶降解，导致PIN蛋白不能在根尖部位积累，进而显著抑制了拟南芥主根的生长[13]。在水稻中，OsHDAC1与根生长有关，[WTBX][STBX]OsHDAC1[WTBZ][STBZ]基因过量表达能够促进水稻根的生长[14]。近期的关于玉米的研究表明，HDAC抑制剂NaB处理引起玉米根分生组织细胞有丝分裂停滞在早前期，根的生长受到严重抑制[15]。虽然HDAC在根生长发育中的功能研究较少，但已有研究充分说明，HDAC对植物根系形成和发育十分重要。
目前，关于木本植物HDAC基因在根生长发育中的功能研究鲜有报道。杨树在世界范围内广泛分布，不仅是重要的造林和工业用材树种，也是木本植物研究的模式植物。本研究分析了HDAC在杨树根再生和生长过程中的功能，这一研究不仅在理论上有利于人们了解杨树根系生长发育的表观遗传调控机制，而且对于通过根系改良提高杨树对水分、营养物质的利用率以及提高杨树抗逆性具有一定的意义。
1材料与方法
1.1供试材料
本研究所用的植物材料84K杨、小黑杨无菌苗，由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室提供。
1.2试验方法
1.2.1杨树无菌苗的继代培养84K杨、小黑杨无菌苗在WPM培养基上培养4～5周，切茎段，将含有腋芽的茎段插入WPM培養基上培养3周，至腋芽萌发、长出幼苗。然后将幼苗从茎段上切下，并放到含有0.1 mg/L IBA的WPM培养基上进行生根培养。WPM培养基含有2%蔗糖、0.1 mg/L IBA、0.6%琼脂，用1 mol/L NaOH调节pH值至5.8。组培苗在温度为（23±2）℃、光—暗周期16 h—8 h的条件下培养。
1.2.2楊樹幼苗的TSA处理将4～5周龄84K杨、小黑杨组培幼苗切茎段，茎段在WPM培养基上培养3周，然后将杨树茎段上由腋芽萌发长出的幼苗用剪刀剪下，分别放在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培养基上进行生根培养，培养温度为（23±2）℃，光—暗周期为16 h—8 h。
1.2.3植株根长、高度的测定将84K杨、小黑杨组培幼苗在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培养基上生根1、2周时，分别测量并记录84K杨、小黑杨再生幼苗的主根长度、植株高度，利用Prism 6软件对数据进行处理，并通过多重比较法分析差异显著性。当P<0.05时，表示存在显著性差异。
2结果与分析
2.1TSA抑制杨树根的再生
2.1.1TSA抑制84K杨根的再生84K杨含腋芽的茎段在WPM培养基上培养3周后，腋芽长出高1.5 cm左右的幼苗；将幼苗用剪刀剪下，分别放在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培养基上生根培养。生根培养1周时，在含有不同浓度TSA的培养基上再生出的不定根长度存在明显差别（图1）。在含有0 μmol/L TSA的培养基上，84K杨幼苗基部能够再生出不定根，不定根平均长度为6.3 mm；在含有1 μmol/L TSA的培养基上，84K杨组培幼苗再生出的不定根平均长度为 2 mm；在含有5 μmol/L TSA的培养基上，84K杨组培幼苗不能再生出不定根。结果表明，TSA处理抑制不定根的再生，TSA浓度越高，对根再生的抑制作用越强。
2.1.2TSA抑制小黑杨根的再生与84K杨相似，小黑杨幼苗不定根的再生受TSA的明显抑制。小黑杨在含有0 μmol/L TSA的WPM培养基上生长1周时，在幼苗
2.2TSA抑制杨树根的生长
2.2.1TSA抑制84K杨根的生长84K杨含腋芽的茎段在WPM培养基上培养3周后，腋芽长出高1.5 cm左右的幼苗，将幼苗用剪刀剪下，分别放在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培养基上生根培养。TSA处理抑制了再生根的生长，而且随着TSA浓度的增加，其根生长受到的抑制作用越大。84K杨幼苗在含有0
2.2.2TSA抑制小黑杨根的生长小黑杨含腋芽的茎段在WPM培养基上培养3周后，腋芽萌发长出高1.5 cm左右的幼苗，将幼苗用剪刀剪下，分别放在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培养基上生根培养。在含有不同浓度TSA的培养基上生长2周时，小黑杨再生根的根长度存在明显差异，TSA浓度越高，根的长度越短，呈负相关趋势。当TSA浓度为0 μmol/L时，植株根的长度平均为5.3 cm；当TSA浓度为1 μmol/L时，植株根的长度明显比0 μmol/L处理时短小，根长平均为1.3 3结论与讨论
组织培养是木本植物快速繁殖的一种有效方式，一些树种在组织培养过程中不定芽或根的再生十分困难。通过改变培养基成分（如营养物质或激素含量和比例）或培养条件（如温度、光照度）仍不能有效获得再生植株。因此，亟需一种方法来实现和提高植物的再生率。表观遗传学是基因表达调控的一种重要方式，对植物生是目前关于表观遗传调控在木本植物不定芽或根再生中的功能鲜有报道。
本研究分析了组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对84K杨、小黑杨2种杨树根再生和生长的影响，结果显示，TSA处理能够显著抑制这2种杨树根的再生和生长，TSA浓度越大，根再
生和生长受到的抑制作用越大。结果表明，HDAC的存在对于杨树根的再生、生长发育具有十分重要的调节作用，也说明杨树根的再生、生长受表观遗传调控。
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