摘 要：目的 探讨缓释血管内皮生长因子复合支架与脂肪干细胞构建工程化脂肪的可行性。方法 制备VEGF-PLGA纳米微球缓释支架，检测支架释放 VEGF 浓度，体外提取培养 ADSCs，检测复合支架对 ASC 生长增殖的影响。将复合支架和ADSCs植入裸小鼠背部，8 周后切取植入物称重，组织切片HE染色，评估效果。结果 VEGF-PLGA纳米微球缓释复合支架能连续 12 d释放较高浓度的VEGF，对 ADSCs的生长增殖无影响。动物实验结果显示复合支架与ADSCs共移植能显著提高脂肪组织的形成，增加血管的生成（P<0.01），减少组织坏死。结论 VEGF-PLGA纳米微球缓释系统具有良好的生物安全性，其与ADSCs共移植构建工程化脂肪组织具有一定的可行性。
关键词：血管内皮生长因子；缓释支架；脂肪干细胞；工程化脂肪
中图分类号：R622+.9 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.22.018
文章編号：1006-1959（2018）22-0064-03
Study on the Relationship between Human Adipose Stem Cells and VEGF-PLGA Nanospheres Slow-release System for Construction of Engineered Adipose Tissue
WANG Yong-heng1，LI Lin-rui1 ，LEI Yu2，HUO Bin-liang1，CAO Wei1
（ Department of Surgical Oncology1，Department of Oncology2，Shaanxi Provincial People"s Hospital，Xi"an 710068，Shaanxi，China）
Abstract：Objective To investigate the feasibility of construction of engineered adipose tissue with sustained-release vascular endothelial growth factor（VEGF） composite stent and adipose stem cells.Methods VEGF-PLGA nanospheres sustained-release scaffolds were prepared and the concentration of VEGF was measured. ADSCs， was extracted in vitro to detect the effect of composite scaffolds on the growth and proliferation of ASC.The composite scaffold and ADSCs were implanted into the back of nude mice. After 8 weeks， the implants were weighed， and the tissue sections were stained with HE to evaluate the effect.Results VEGF-PLGA nanospheres sustained-release composite scaffolds could release higher concentration of VEGF， for 12 d without any effect on the growth and proliferation of ADSCs.The results of animal experiments showed that co-transplantation of composite scaffold and ADSCs could significantly increase the formation of adipose tissue， increase angiogenesis （P<0. 01）， and reduce tissue necrosis.Conclusion VEGF-PLGA nanospheres sustained-release system has good biological safety and it is feasible to co-transplant with ADSCs to construct engineered adipose tissue.
Key words：Vascular endothelial growth factor；Sustained-release scaffold；Adipose-derived stem cells；Engineered adipose tissue
脂肪干细胞 （adipose-derived stem cells，ADSCs）是来源于脂肪组织的一种间充质干细胞，具有多向分化潜能，其应用于乳房重建的优势是组织来源充足、取材简便，同时其无免疫排异的风险，能用于自体移植、同种异体移植，甚至异种移植[1]。临床上常见有因乳房发育不良、肿瘤切除、外伤等原因引起的小乳症、乳房的缺失等，可能引起患者严重的身心障碍。现有的乳房填充材料存在生物相容性差、结构稳定性差等缺点。寻找合适的乳房重建材料是目前乳腺外科研究的重点。自体脂肪组织是目前进行乳房填充和重建的最佳材料，但其来源受到很大限制，并且效果不稳定。自体脂肪颗粒移植存活率低，且易发生坏死、液化、纤维化、钙化等，难以大量获取，故难以广泛应用。而随着材料学的发展，各种缓释支架的应用在为诱导干细胞分化、促进血管生成和增加血供并提高植入物的存活率提供了新的思路[2，3]。本研究首先提取培养 ADSCs，再制备能血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 缓释聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球复合支架（polylactic-co-glycolic acid，PLGA），将ADSCs与复合支架植入裸小鼠的背部，通过测量植入物的重量、组织切片 HE 染色观察，探讨ADSCs和复合支架移植进行组织工程化脂肪构建的可行性。
1材料和方法
1.1主要试剂 血管内皮生长因子（VEGF蛋白，50 μg）购自 PeproTech 公司；Ⅰ型胶原酶（60 U）购自Sigma公司；VEGF- ELISA试剂盒（96 t）购自北京健平九星生物医药科技有限公司；水溶性四唑盐 WST-1试剂（100 mg）购自东仁化学科技有限公司。
1.2实验动物及分组 选择 4～6 周龄雌性裸小鼠10只（空军军医大学动物实验中心提供），所有实验动物均在该中心SPF级动物房中分笼饲养，饮水、饲料等物品均灭菌处理后使用，实验操作按无菌原则进行。
1.3实验方法
1.3.1脂肪干细胞提取和培养 脂肪组织来源于我院肿瘤外科行副乳切除的脂肪组织，总量约10 ml，剪成约为1 mm3 的小块，PBS反复冲洗。加入0.1% Ⅰ型胶原酶进行原代细胞分离和接种培养。24 h后换液1次，以后每2～3 d换液，待细胞密度达80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化后传代培养。选取生长良好的第3代细胞做多向分化及体内实验，观察原代及传代脂肪干细胞ADSCs形态及生长状况。
1.3.2血管内皮生长因子-聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球制备 VEGF蛋白溶解得到内水相（W2）。PLGA 溶入二氯甲烷溶液中，作为油相（O）。将W2 移入O中，涡旋振荡后得到初乳。将初乳加入体积分数5%聚乙烯醇溶液[外水相（W1）]中，磁力搅拌后，得到W/O/W乳液。将此乳液转移到 124 ℃、100 ml 5 g/L的氯化钠水溶液中，搅拌后收集固化的蛋白微球，用超纯水洗涤 3遍，冷冻干燥备用。将适量 VEGF-PLGA 微球分散在导电双面胶上的铝箔纸上，喷金后，置于电镜下观察。
1.3.3 ADSCs增殖影响的测定 取第3代ADSCs，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为 5×104个/ml，接种于 96 孔板中，每孔加入100 μl悬液。每组设3个复孔，A组为单纯细胞悬液，B组每孔加入 50μg復合支架粉末，置于 37 ℃、 5%CO2恒温培养箱中培养。每 24 h取1块板，每孔加入10μl的WST-1工作液，于37 ℃恒温箱孵育2.5 h，使用酶标仪450 nm波长测定吸光度（OD）值，记录结果，连续测8 d。
1.3.4支架与 ADSCs 的裸小鼠移植 动物实验按照西安交通大学医学院实验动物伦理审查委员会相关规定执行。取4～6周龄雄性无胸腺鼠10只，2%戊巴比妥麻醉后，在背部脊椎两侧各选取1个位置，一侧植入脂肪干细胞-VEGF-PLGA纳米缓释复合物，同样方法在另一侧植入无支架细胞液，术后肌肉注射青霉素钠预防感染。8周后，处死裸小鼠，观察移植区域内有无新生组织形成，大体观察新生组织的形态及支架残留情况，完整取出植入物，测量植入物的重量。同时将植入物放入戊二醛缓冲液中固定，行苏木精-伊红染色（HE染色）。
1.4统计学处理 用 SPSS 13.0软件行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，两组均数比较采用t检验或单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 VEGF-PLGA的复合支架的表面特征 扫描电镜观察显示：VEGF-PLGA呈圆形球体，形态较一致，表面光滑无孔隙，无粘连，无塌陷及萎缩现象，其粒径为 4～10 μm，见图 1。
2.2复合支架中 VEGF的体外释放动力学 用ELISA试剂盒测定VEGF的体外缓释效果。经检测， VEGF-PLGA微球释药率为（20.00±1.84）% ，复合支架于第3天达到VEGF最高释放浓度，约为1900 pg/ml，从第4天开始释放量逐渐减少，至第12天释放浓度仍维持在 600 pg/ml 以上，见图2。
2.3 ADSCs的形态及活性测定 原代细胞培养6 h后开始有少量成纤维细胞样细胞散在贴壁，24 h后大部分贴壁细胞呈宽大扁平的成纤维细胞样细胞，随培养时间延长，贴壁细胞呈典型的长梭形。连续传代培养至15代，细胞未出现明显衰老现象，见图3。WST-1 法测定ADSCs的生长曲线， 同时检测复合支架对ADSCs增殖力的影响。ADSCs在培养4 d 后进入对数生长期，第6天进入生长平台期。 复合支架与ASC 共培养的生长曲线与 ASC 的生长曲线基本吻合，复合支架对增殖无明显影响（见图4）。
2.4复合支架对ADSCs移植的影响 植入后动物生长情况良好，移植后8 周观察植入物的性状（见图5）。实验组可见血管增生并长入材料，有轻度纤维包裹现象；对照组有少量血管增生，也有轻度纤维包裹现象。两组新生组织湿质量分别为（0.13±0.01） g和（0.09± 0.01） g，统计学意义显著（P<0.01）。
两组移植物与皮下筋膜间界面清晰，充满细胞成分，苏木精-伊红染色均可见移植物中有新生脂肪组织形成和不同程度的微血管长入新生组织中，实验组仍有部分支架材料未被降解吸收，对照组组织内部出现缺血坏死（见图6）。组织切片 HE 染色结果显示两组微血管数分别为（40.52±3.63）条/200 倍视野和（16.81±2.92）条/200倍视野，统计学意义显著（P<0.01）。
3讨论
细胞因子是组织工程中三大重要因素之一。应用足量的生长因子可促进组织工程化脂肪组织的形成。合理将细胞因子整合入组织工程支架是目前干细胞组织工程研究的热点。外源性生长因子的引入主要可通过培养液中直接添加[4]、转基因细胞表达[5]以及构建缓释多聚体[6]等方法来实现。直接添加的生长因子在体内半衰期非常短，难以持续发挥作用，反复注射价格昂贵，并有可能引起毒性和免疫反应。利用转基因技术可使种子细胞表达重组促血管生成生长因子，并释放促血管生成生长因子，但基因转染技术目前仅停留在实验室阶段，其远期安全性仍有待进一步观察。用微球颗粒和纳米颗粒包裹生长因子或药物来作为缓释载体，取得了较理想的结果。本研究使用的PLGA支架能缓释细胞因子，复合支架能连续 12 d释放较高浓度的VEGF，基本达到缓释的效果，且释放量能维持VEGF的有效作用浓度。复合支架与 ADSCs共培养的生长曲线显示，复合支架对 ASC 的生长增殖无明显影响，表明VEGF-PLGA复合支架具有良好的生物相容性和安全性。
组织工程组织的构建受限于构建组织的血管化程度。选择与血管生成相关的生长因子，可以增强组织工程化脂肪的血管化，从而加速血运的建立，减少脂肪细胞的坏死和吸收。在所有的生长因子中，VEGF对于血管内皮细胞的作用是最直接、最专一的[7，8]。应用干细胞进行组织再造时，体外注射 VEGF 或将 VEGF 基因导入干细胞可显著增加新生血管的数量，减少再造组织的缺血坏死[9]，但其应用因半衰期短及价格昂贵而受到制约。
支架材料为组织工程的构建提供必要的细胞黏附增殖的空间，性能优良稳定的支架材料对构建组织工程脂肪必不可少[2，3]。PLGA 由乳酸和羟基乙酸这 2 种单体聚合而成，是一种可降解的高分子有机化合物，具有良好的生物相容性，广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。PLGA 作为应用最早最成熟的可生物降解微球的骨架材料，具有延缓药物降解、延长药物释放时间、靶向释放、降低药物毒性和刺激性等优点[10]。本实验亦采取PLGA作为骨架材料，构建纳米缓释微球，并于实验中取得了良好的效果，且实验发现与脂肪干细胞共培养8周，其支架材料仍未被完全降解吸收，说明PLGA作为支架材料具有很高的稳定性。
本实验将ADSCs与缓释 VEGF 的复合支架一起移植到裸小鼠的背部，移植物8周后取出，组织学检测发现实验组和对照组均见新生脂肪组织形成，实验组的平均湿质量和新生微血管数大于对照组，由此可见VEGF-复合支架能提高脂肪干细胞的成脂分化能力，并促进移植物种子细胞的存活及血管化过程，因而可構建出体积较大的组织工程脂肪。
综上所述，本研究采用的血管内皮生长因子-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（VEGF-PLGA）缓释支架具备良好生物安全性，能较长时间释放较高剂量的 VEGF。且复合支架与ADSCs共同移植能生成更多的新生脂肪及新生微血管。其与 ASC 共移植构建工程化脂肪组织具有一定的可行性。
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收稿日期：2018-8-26；修回日期：2018-9-5
编辑/肖婷婷
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