摘要：通过静置富集和分离纯化等步骤从自然腐烂的水果中分离得到6株产细菌纤维素的菌株。从腐烂的芒果中筛选得到1株可产细菌纤维素的混合菌，混合菌产量为湿重617.3 g/L、干重23.9 g/L。经过分离纯化确定该混合菌中只有1株产细菌纤维素菌株M7，在传代培养过程中M7菌株细菌纤维素产量最高且稳定。对M7菌株进行形态特征、生理生化特征和16S rRNA分子序列分析，初步确定M7菌株为葡糖醋杆菌，16S rDNA分子序列已提交至GenBank，序列号为JX303335。
关键词：细菌纤维素；筛选；鉴定；葡糖醋杆菌属
中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3514-04
纤维素是自然界中含量最多的生物聚合物。植物纤维素含有半纤维素、木质素、果胶等杂质而影响了其使用的广泛性，工业上为了去除细胞壁中的木质素以获得纤维素，需要应用对环境有害的化学物质并且只能得到植物中50%的纤维素[1]。细菌纤维素是在1886年被首次报道的，它是由细菌产生的一种结构特点和力学特性不同于植物纤维素的纯度很高的纤维素[2]，它的优良特性弥补了植物纤维素的不足之处。细菌纤维素是由微生物合成的一种生物纳米材料，与植物纤维素相比，具有独特的三维网络结构和超细、纯度高、结晶度高、与水结合能力强和机械性能优良等特点，成功应用于很多领域，是当今国内外生物材料研究的热点之一[3]。由微生物产生的细菌纤维素产量低且生产成本高，很难应用于工业上的大规模生产，因此筛选出一种高产量的菌株至关重要。本试验以自然腐烂的水果为原料，筛选得到1株高产菌株M7，经过对M7菌株的形态特征、生理生化特征和16S rRNA分子序列分析初步鉴定为葡糖醋杆菌属。根据前人所做的研究结果[4，5]，本试验将菌株培养条件设置为30 ℃培养，pH 6.0，碳源为蔗糖。
1 材料与方法
1.1 仪器设备
VS-1300洁净工作台、SPX-250-Z型生化培养箱、HVE-50全自动灭菌器、VITEK-32全自动微生物鉴定仪、Bio-rad iCycler梯度PCR仪、G-130XHR凝胶成像系统、Eppendorf 5810R冷冻离心机、DM2500和DM4200显微镜、TIANGEN琼脂糖凝胶电泳DNA回收试剂盒等。
1.2 试验材料
1.2.1 菌种来源 芒果等19种自然腐烂的水果。
1.2.2 培养基 富集培养基（W/V）：5%蔗糖，0.5%酵母浸出粉，0.5%蛋白胨，0.5% K2HPO4·3H2O，0.5% Na2HPO4·12H2O，0.1%柠檬酸（C6H8O2·H2O），0.025% MgSO4·7H2O，pH 6.0；固体分离培养基（W/V）：3%蔗糖，0.5%酵母浸出粉，0.5%蛋白胨，0.5% K2HPO4·3H2O，0.5% Na2HPO4·12H2O，0.1%柠檬酸（C6H8O2·H2O），2%琼脂，pH 6.0；发酵培养基（W/V）和种子培养基（W/V）：成分与富集培养基相同；所用培养基和所用玻璃仪器在使用之前都要经过121 ℃灭菌20 min。
1.3 试验方法
1.3.1 样品处理 将腐烂的水果切碎后放置于小烧杯内，向烧杯中加入无菌生理盐水，使水面淹没水果，室温下振荡30 min，使水果上的细菌充分地溶入到生理盐水中[6]。
1.3.2 菌种分离 吸取10 mL浸泡过腐烂水果的生理盐水注入到90 mL富集培养基中，放在恒温培养箱中30 ℃条件下静置富集培养7 d。再吸取10 mL富集培养液于90 mL富集培养基中，如此富集继代分批培养[7]进行5次后，富集培养液表面依然有膜的再进行梯度稀释分离纯化。梯度稀释至10-15选取10-9～10-15的浓度各吸取100 μL稀释菌液，用无菌的玻璃珠涂布于固体分离培养基制成的平板上，放在恒温培养箱内30 ℃培养1 d。挑取平板上的单菌落接种于种子培养基上，160 r/min 30 ℃振荡活化培养24 h，以6%的接种量接种于发酵培养基上，30 ℃静置培养7 d，观察培养液表面有白色的膜生成的菌种即有可能是产纤维素菌株。
1.3.3 产物鉴定 取出培养液表面的膜，用去离子水冲洗3～5次，洗去表面杂质，放入5%的NaOH溶液中100 ℃处理2 h后，如果培养液表面的膜不分解则证明这种膜是细菌纤维素[2]，对应菌株就是可产细菌纤维素的菌株。
1.3.4 产量测定 取出纤维素膜后用去离子水冲洗3～5次，再用0.1 mol/L的NaOH溶液煮沸至纤维素膜呈透明或白色，去除其中的培养基和菌体即可，取出处理过的细菌纤维素膜后用去离子水冲洗纤维素膜至pH 7.0[8]。将纤维素膜铺平后测量膜的厚度[2]，沥干膜的表面水分，即为纤维素湿膜，称量湿膜的重量为纤维素膜的湿重[8，9]。纤维素膜放在80 ℃条件下过夜烘干后称取干重[10]。细菌纤维素产量分别表示为：纤维素湿（干）重/培养液体积。
1.3.5 生理生化鉴定在固体分离培养基上30 ℃划线培养M7菌株，18 h后挑取单菌落革兰氏染色，制备合适浓度的菌悬液，具体处理过程和文献[11]相同。用VITEK-32全自动微生物鉴定仪和革兰氏阴性菌鉴定卡对M7菌株进行生化鉴定。
1.3.6 分子鉴定按照氯仿-苯酚混合法提取M7菌株基因组DNA[12]后，在94 ℃ 5 min，（94 ℃ 45 s；54 ℃ 45 s；72 ℃ 2 min）循环35次，72 ℃ 10 min条件下PCR，所用引物为27F（5′-AGAGTTTGATCC
TGGCTCAG-3′），1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTA
CGACTT-3′）。PCR扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳，用TIANGEN琼脂糖凝胶电泳DNA回收试剂盒回收纯化PCR产品，测序后将16S rRNA分子序列提交到NCBI进行BLAST比较，初步确定M7菌株的种属。
2 结果与分析
2.1 筛选结果
从19种腐烂水果中筛选出108株不同种类的细菌，其中从山楂中筛选出的3个菌株：SZ4，SZ5，SZ6和从苹果中筛选出的PG6以及从番茄中筛选出的FQ2均可产纤维素，从芒果中筛选出的1株天然混合菌可以产细菌纤维素，从这株混合菌中分离出1种产纤维素菌株M7。在发酵培养基中培养15 d后测得6种产细菌纤维素菌株的产膜情况和pH等基本特征见表1。
由表1可知，M7菌株纤维素产量最高，开始产膜所需时间最短，持续产膜时间最长，经过连续传代培养产量稳定，M7菌株培养14 d后的最终pH为4.0，初始pH为6.0，生长pH明显下降，适合生长的pH为4.0～6.0。M7菌株在160 r/min，30 ℃条件下振荡培养14 d和30 ℃条件下静置培养相同时间后，测得产量和pH见表2。
由表2可知，M7菌株在静置条件下培养细菌纤维素产量更高，表明M7菌株更适合在静置条件下培养产细菌纤维素。
2.2 菌株特征
2.2.1 形态特征 M7菌株在培养40 h后的菌落直径为0.4～0.5 mm，白色，表面光滑，菌落周围整齐。M7菌株菌落在显微镜下的形态如图1所示，M7菌菌落外观如图2所示。
M7菌株经革兰氏染色后的显微照片如图3所示，由图3可知，M7菌株在显微镜下为短杆状，长1.1～1.6 μm，宽0.4～0.5 μm，革兰氏染色为阴性。
2.2.2 生理生化特征 M7菌株革兰氏染色为阴性，氧化酶阴性，接触酶阳性，用革兰氏阴性菌鉴定卡和ITEK-32全自动微生物鉴定仪鉴定[11]该菌株为葡糖醋杆菌属。
2.2.3 分子鉴定结果 采用菌株通用引物27F和1492R进行PCR扩增，空白对照组不加模板DNA，其余操作完全一样，用1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图4，回收纯化PCR样品送TaKaRa公司测序，结果表明M7菌株16S rRNA全长1 453 bp，将16S rRNA分子序列提交到NCBI进行BLAST比较初步确定为葡糖醋杆菌属，这和通过VITEK-32全自动微生物鉴定仪鉴定结果相吻合，将M7菌株16S rDNA序列提交到GenBank，序列号为JX303335。
2.3 细菌纤维素形态特征
图5、图6分别为100 mL培养液的M7菌株30 ℃静置培养14 d所产的细菌纤维素膜在用NaOH溶液处理前后的状态。图7为M7菌株在160 r/min、30 ℃振荡培养条件下所产纤维素的形态图。由图5和图6可知，M7菌株在30 ℃静置培养14 d所产细菌纤维素膜硬实、有弹性，而M7菌株在30 ℃振荡培养14 d后产的细菌纤维素为白色颗粒状（图7）。
2.4 混合菌产量比较
对起初分离出M7菌株的混合菌的产膜情况进行了分析。经过分离纯化确定混合菌中只有1种产细菌纤维素菌株M7，混合菌和M7菌株分别在发酵培养基中30 ℃静置培养至产膜终止后，测定其产膜状况（表3）。由表3可知，混合菌的细菌纤维素产量和产膜持续时间都明显比M7菌株单独培养时的高。
3 结论
1）从自然腐烂的水果中筛选出6株产细菌纤维素菌株，其中从芒果中筛选出的M7菌株纤维素产量最高且产量稳定；
2）通过对M7菌株不同培养条件下的产量对比，发现M7菌更适合在静置条件下产细菌纤维素，适合生长的pH为4.0～6.0；
3）M7菌株经过形态鉴定、生理生化特征分析和16S rDNA分子序列分析初步确定为葡糖醋杆菌；
4）M7菌株是从1株高产混合菌中分离纯化得到的细菌，M7菌株在同其他8种单独培养不产细菌纤维素的细菌混合培养时湿重产量达617.3 g/L，干重产量为23.9 g/L，说明M7菌株是一种高产细菌纤维素菌株。
4 讨论
M7菌株在富集继代分批培养过程中能否占优势，取决于它与其他菌的比生长速率的竞争，在试验所采用的培养条件下要保持一定的选择压力使目的菌维持最大的比生长速率，就要严格控制移种时间和次数[7]，本研究采用30 ℃条件下静置培养7 d后，以10%的接种量富集培养获得了较好的效果。
另外，从混合菌产量和单独M7菌株培养时的产量比较可知，混合菌的细菌纤维素产量和产膜持续时间都明显比M7菌株单独培养时的高。故推测多种细菌共同生长时M7菌株可能会从其他细菌获得促进M7菌株产细菌纤维素的物质，经过多次富集继代分批培养后逐渐改变了混合菌中各种细菌的数量比，在每隔7 d富集继代分批培养传代一次的条件下，最终M7菌株成为优势菌群，其他各种细菌数量比适当的条件下可以使细菌纤维素产量有效提高，但是在混合菌培养时是何种营养成分促进了细菌纤维素产量的提高以及混合菌的种类和数量需要进一步的研究。
参考文献：
[1] CHENG K C， JEFFREY M C. Effect of different additives on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum and analysis of material property[J]. Cellulose，2009，16：1033-1045.
[2] NARAYANASWAMY B， HEGDE S V. Bacterial cellulose producing gluccano Acetobacter xylinum： isolation and screening[J]. Asian J of Microbiol，2010，12（3）：549-554.
[3] 周伶俐.细菌纤维素生产菌的筛选、发酵及应用的研究[D]. 南京：南京理工大学，2008.
[4] AKIHIRO K，CHIZURU S. Utilization of various fruit juices as carbon source for production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum NBRC 13693[J]. Carbohydrate Polymers，2009， 79：333-335.
[5] AKIRA S， YUKIKO K， NAOTO T， et al. Screening of bacterial cellulose-producing acetobacter strains suitable for sucrose as a carbon source[J]. Biosci Biotech Biochem，1997，61（4）： 735-736.
[6] BASAVARAJ S， HUNGUND S G. Production of bacterial cellulose from enterobacter amnigenus GH-1 isolated from rotten apple[J]. World J Microbiol Biotechnol，2010，26：1823-1828.
[7] 余龙江.发酵工程原理与技术应用[M].北京：化学工业出版社，2011.
[8] 毋锐琴，李志西，邵东燕，等.高产细菌纤维素菌株的分离及初步鉴定[J].中国酿造，2008，10，37-38.
[9] 毋锐琴，杜双奎，李志西，等.细菌纤维素发酵培养基的优化及超微观结构分析[J].生物工程学报，2008，24（6）：1068-1074.
[10] 李 静. 细菌纤维素的制备及结构与性能研究[D].山东青岛：青岛大学，2008.
[11] 陈太基，封幼玲，戴建华，等.VITEK全自动微生物分析系统的应用与研究[J].中国卫生检验杂志，1997，7（5）：262-266.
[12] 马 霞，王瑞明，关凤梅，等.细菌纤维素生产菌株的分离和菌种初步鉴定[J].工业微生物，2005，35（3）：23-26.
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