摘 要：目的 为了探究人驱动蛋白分子Kif4A在有丝分裂过程中的作用及其调节机制，需要在体外表达并纯化有活性的Kif4A蛋白。方法 构建了驱动蛋白Kif4A的体外真核表达载体pFastBac-Kif4A，将其转化到DH10Bac感受态细胞中，通过蓝白斑筛选得到阳性克隆，抽提得到杆状病毒基因组。由于杆状病毒基因组较大，标准的转染方法转染效率较低，对该方法进行了优化。将杆状病毒基因组通过标准的和优化的转染方法转染到草地夜蛾卵巢细胞SF9中，经培养得到表达驱动蛋白Kif4A的初代杆状病毒。结果 通过检测初代杆状病毒的滴度， 我们发现，与标准的转染方法相比，优化的转染方法所得到的初代杆状病毒的滴度更高，相同稀释度感染条件下表达的Kif4A蛋白水平更高。结论 本研究成功构建了Kif4A杆状病毒表达系统，并优化了SF9细胞转染的方法，为后续大量表达和纯化Kif4A蛋白奠定了基础。
关键词：驱动蛋白 Kif4A 杆状病毒 脂质体转染
中图分类号：Q291 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2018）09（c）-0235-05
昆虫杆状病毒表达系统是一种以昆虫杆状病毒为外源基因表达载体，昆虫细胞作为表达受体的外源基因真核表达系统[1]。与原核表达系统相比，昆虫杆状病毒表达系统具有安全性好、重组蛋白表达量高、重组蛋白翻译后加工等特点，因而得到了广泛的应用。这种表达系统除了可以大量高效的表达所需要的目的蛋白，同时在表达过程中可以进行翻译后修饰，使目的蛋白的免疫原性、ATP酶活性等生物活性与天然蛋白基本相同[2]。因此，应用昆虫杆状病毒表达系统进行目的蛋白的表达，可以大量高效的得到与天然蛋白基本相同的蛋白质。
驱动蛋白分子（Kinesin）是细胞内以微管为轨道的通过水解ATP进行移动的马达蛋白。此类蛋白分子是细胞内主要的运输工具，不仅在细胞中起着运输的功能，而且对细胞有丝分裂过程起极其重要的作用。Kif4A是kinesin-4家族成员，基因定位于人类染色体Xq13.1，cDNA长度为3699bp，编码1232个氨基酸，蛋白相对分子量约140kDa。与其他驱动蛋白分子相同，Kif4A蛋白也由3个保守的功能域组成：N端球形的马达结构域（motor domain）；中央卷曲螺旋杆状结构域（stalk domain），和C端扇形的尾部（tail domain）。在细胞中Kif4A通过中间的杆状螺旋区形成同源二聚体；通过C端的尾部结合相应的“货物”；通过N 端球形结构域结合到微管上，向微管的正极末端移动。在有丝分裂过程中Kif4A功能的发挥依赖于有丝分裂过程中蛋白激酶的磷酸化调节。在有丝分裂早期，Kif4A主要受CDK1激酶磷酸化修饰，修饰发生在T1161位点，修饰后的Kif4A定位于染色体上，参与染色体的凝集和中板集合，在有丝分裂晚期，Kif4A主要受Aurora B激酶磷酸化修饰，修饰发生在T799和S801位点，修饰后的Kif4A集中在纺锤体中央区（spindle midzone）和中小体（midbody）上，协助姐妹染色单体的分离和纺锤体中央区（midzone）及中小体（midbody）的形成。磷酸化的修饰使Kif4A具备了不同的功能，进而调节有丝分裂的进程。但是Kif4A的不同磷酸化之间的关系仍不清楚，明确驱动蛋白Kif4A磷酸化调节的相互关系，有助于了解磷酸化修饰对Kif4A ATP酶活性调节的机制，同时更深入的阐明细胞有丝分裂过程。
为了研究Kif4A不同修饰的相互关系，我们需要体外表达并纯化天然构象的Kif4A蛋白。我们拟构建Kif4A的体外真核表达载体pFastBac-Kif4A，转化DH10Bac感受态，得到杆状病毒基因组，通过转染SF9昆虫细胞得到杆状病毒，并表达和纯化Kif4A蛋白。由于杆状病毒基因组较大，传统的方法转染效率较低，无法得到高滴度的杆状病毒，本研究通过对转染过程的优化，得到了滴度更高，蛋白表达水平更高的杆状病毒，为体外转染SF9细胞提供了新的方法，同时为进一步研究Kif4A在有丝分裂过程中的功能奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 质粒和菌株
pFastBacHTb真核表达载体、pEGFPC1真核表达载体、pEGFP-kif4A真核表达载体为本实验室自存；大肠杆菌感受态细胞Trans T1购自北京全式金生物技术有限公司、大肠杆菌感受态细胞DH10Bac购自上海唯地生物技术有限公司；草地夜蛾卵巢细胞SF9为本实验室保存细胞株。
1.1.2 主要试剂与仪器
2×Taq Master Mix（南京诺唯赞生物技术有限公司）；限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ、BglⅡ以及Superfect轉染试剂（美国QIAGEN公司）；T4DNA连接酶、Super DNA Marker（北京康为世纪生物科技有限公司）；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；特异性多克隆兔抗Kif4A抗体，实验室自制；特异性单克隆鼠抗Flag抗体，美国Sigma公司；细胞培养及SIM SF（北京义翘神州科技有限公司）；其他化学试剂为进口或国产分析纯。DNA序列测定和引物合成均由北京中美泰和生物技术有限公司完成。
Mycycler普通PCR仪（北京汇力宏业生物技术有限公司）、Nikon TS100倒置显微镜（日本Nikon公司）、BG-Power600通用电泳仪（北京百晶生物技术有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 pFastBac- Kif4A载体的构建
将连接到pEGFPC1质粒上的kif4A切下，连接到pFastBacHTb质粒上。pFastBacHTb质粒通过BamHⅠ和SalⅠ双酶切；pEGFPC1-kif4A质粒通过SalⅠ和BglⅡ双酶切；酶切产物经过凝胶回收试剂盒回收，按照适当的比例用T4 DNA连接酶室温连接1h，将所得全部连接产物转化Trans T1感受态细胞，涂布在LB-AMP+（含氨苄青霉素）抗性固体培养基过夜培养，筛选阳性克隆，利用质粒提取试剂盒提取质粒后进行双酶切鉴定。将初步鉴定正确的质粒送北京中美泰和生物技术有限公司测序。
1.2.2 转化DH10Bac感受态细胞
将所得到的正确的pFastBac- Kif4A质粒转化到DH10Bac感受态细胞中，细胞复苏4h后，涂布到含有Tet+、Kan+、Gen+（含四环素、卡那霉素、庆大霉素）3种抗性的LB固体培养基上。37℃避光培养48h。由于pFastBacHTb质粒在DH10Bac感受态细胞中会发生转座，转座的发生破坏了细胞中的Lac Z的基因，使细胞不能分解X-gal而形成白色的克隆。经过蓝白斑筛选，挑取3个白色克隆，在新的固体培养基上划线培养，37℃培养16～24h，进一步验证白色克隆确实发生了转座。
1.2.3 杆状病毒基因组的提取及验证
挑取经验证发生转座的克隆至含有Tet+、Kan+、Gen+（含四环素、卡那霉素、庆大霉素）三种抗性的LB液体培养基，37℃过夜培养，提取杆状病毒基因组。将菌液转移到1.5mL离心管中，14000g离心1min；吸弃上清，0.3mL溶液I[15mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L EDTA，100μg/mL RNase A]重悬菌体，加0.3mL溶液II（0.2 mol/L NaOH， 1% SDS），颠倒混匀后室温孵育5min；加入0.3mL 3mol/L醋酸钾，颠倒混匀后冰上孵育5min；14000g室温离心10min；将上清转移到新的装有0.8mL异丙醇的1.5mL离心管中，混合均匀后冰上孵育5min；14000g室温离心15min；吸弃上清，加入0.5mL 70%的乙醇，14000g室温离心5min；吸弃上清，室温干燥5min，50μL超纯水溶解沉淀DNA。用所得杆状病毒基因组进行PCR验证转座的发生，引物序列：M13-Fwd 5"-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3"；Kif4A-antisense 5" GCACTGATTACATTTCCC 3"。
1.2.4 SF9细胞培养与SF9细胞转染
SF9细胞用SIM SF培养基，27℃下，120r/min悬浮培养。转染前，将SF9细胞接种于6孔板，每孔2mL SIM SF培养基中接种1×106个细胞，27℃下细胞贴壁1h后进行杆状病毒基因组转染。1μg重组杆状病毒DNA稀释到150μL SIM SF培养基中，15μL Superfect转染试剂稀释到150μL SIM SF培养基中，将基因组与转染试剂混合均匀后，室温孵育20min。標准的转染方法：20min后，去除旧的培养基，加入1.7mL新培养基，滴入转染混合液，转染5h后换液，去除转染混合液，加入2mL含环丙沙星抗生素的SIM SF培养基，27℃培养4d。优化的转染方法：20min后，去除旧的培养基，加入0.7mL新培养基，滴入转染混合液，转染5h后，加入1mL含两倍环丙沙星抗生素的SIM SF培养基，27℃培养4d。4d后得到的细胞培养基，500g离心5min，收集杆状病毒，4℃保存。
1.2.5 杆状病毒滴度的鉴定
24孔板中接种5×104个细胞，细胞贴壁1h后，按照设置好的浓度梯度，1：1、1：10、1：50、1：200、1：500、1：1000分别加入杆状病毒，细胞培养72h，收取细胞，100μL 1×的loading buffer（SDS质量分数为2%，甘油体积分数为10%，Tris-Cl浓度为50mmol/L，pH为6.8，β-巯基乙醇体积分数为1%，溴酚蓝质量分数为0.004%）裂解，Western Blot检测蛋白水平。
1.2.6 Western Blot 检测蛋白表达
取20μL裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定电流为30mA，分离蛋白质1.5h后，半干转印电泳槽转移蛋白质至PVDF膜上，质量分数为50mg/mL的脱脂奶粉封闭30min后，以鼠抗Flag标签为一抗室温孵育2h，以偶联了辣根过氧化物酶的羊抗鼠抗体为二抗室温孵育1h，将增强化学发光剂（ECL）与H2O2混合后，与PVDF膜孵育3min，暗室内用X射线胶片进行显影。
1.2.7 杆状病毒的扩增
6cm平皿中接种3×106个细胞，细胞贴壁1h后，加入20μL的杆状病毒，培养72h后，收取细胞培养液，500g离心5min，将上清转移到新的离心管中，4℃保存。
2 结果
2.1 pFastBac- Kif4A载体的构建
将用SalⅠ和BglⅡ双酶切的pEGFP-Kif4A质粒和用BamHⅠ和SalⅠ双酶切的pFastBacHTb质粒进行琼脂糖凝胶电泳，如图1（A）所示。之后通过割胶回收得到Kif4A和pFastBacHTb线性DNA，如图1（B）所示。通过T4连接酶室温连接1h，连接产物转化Trans T1感受态，挑取阳性克隆，如图1（C）。通过质粒提取试剂盒提取pFastBac-Kif4A质粒。质粒经过测序，与NCBI公布的序列比对，DNA序列信息相同，证明pFastBac- Kif4A质粒构建成功。
2.2 pFastBac-Kif4A质粒在DH10Bac感受态细胞中的转座与验证
将构建好的pFastBac-Kif4A质粒转化至DH10Bac感受态细胞中，48h后观察培养基上蓝白斑克隆的状况，挑取3个待鉴定的白色克隆划线到新的培养基上，24h后观察菌落颜色，如图2（A）所示，经鉴定菌落颜色确实为白色。挑取白色克隆，过夜培养，提取杆状病毒基因组，通过PCR的方法验证转座的发生，如图2（B）所示，PCR产物电泳图可以看到明显的条带，且大小与理论值相符，证明转座成功。
2.3 杆状病毒基因组转染SF9细胞
应用标准的和优化的转染方法进行SF9细胞转染，显微镜下对细胞进行观察。可以发现，对照组细胞是未经过任何处理的，细胞形态和大小正常，大多数细胞贴壁；标准的转染方法中，只有小部分细胞变圆、变大，并且贴壁不牢（图3黑框所示）；而优化的转染方法中，大部分细胞变圆、变大，贴壁效果明显降低，如图3所示。
2.4 SF9细胞的感染与病毒滴度鉴定
为了进一步检测杆状病毒的滴度，我们将转染SF9细胞得到的桿状病毒按照设置好的浓度梯度感染SF9细胞，利用Western blot检测Kif4A蛋白的表达水平。如图4（A）所示，从图中可以明显的观察到，优化的转染方法在1∶50的感染比例下就能够大量表达Kif4A蛋白，而标准的转染方法只有在1∶10以上的感染比例下才能表达较高水平的Kif4A蛋白。通过对比Kif4A的蛋白表达水平可以发现，与标准的转染方法相比，优化的转染方法得到的杆状病毒滴度水平较高，蛋白表达也较高，如图4（B）所示。因此，优化的转染方法得到了更高滴度的杆状病毒，且Kif4A蛋白的表达水平更高。
3 讨论与结论
驱动蛋白Kif4A在有丝分裂过程中发挥着重要作用。在细胞有丝分裂过程中，干涉Kif4A的表达，会使细胞有丝分裂受到阻碍，进而使细胞有丝分裂发生紊乱，导致基因组不稳定性的发生。了解Kif4A在有丝分裂中的重要作用及其调节机制对于更好的阐述有丝分裂进程具有至关重要意义。
本研究利用杆状病毒感染SF9细胞表达并纯化Kif4A蛋白，但由于杆状病毒基因组较大，标准的转染方法转染效率较低，得到的杆状病毒滴度水平也就较低，不能有效地表达目的蛋白。我们通过对转染方法进行优化，提高了转染效率，得到的杆状病毒的滴度更高。转染过后，收集得到可以大量表达Kif4A蛋白的杆状病毒，与标准的转染方法相比，优化的转染方法得到的杆状病毒表达Kif4A蛋白的水平更高。我们推测这是因为优化的转染方法没有将转染混合液去除，目前所用的转染试剂对细胞的伤害很小，在有转染试剂存在的条件下，虽然杆状病毒基因组较大，但是可以持续的将杆状病毒基因组转染到SF9细胞中，从而提高了转染效率。杆状病毒基因组在SF9细胞中大量表达杆状病毒，这就使得到的杆状病毒滴度水平较高，杆状病毒滴度水平高就会更高效地进行蛋白表达，所以蛋白的表达较高。优化的转染方法操作简便，对SF9细胞影响小，得到的病毒滴度水平较高，重组蛋白的表达水平较高，缩短了实验周期，加快了后续实验的进程。
综上所述，本研究优化了SF9细胞的转染方法，成功地构建了可以体外大量表达驱动蛋白Kif4A的杆状病毒表达系统，通过体外表达和纯化Kif4A蛋白，可以进行大量的体外实验，为进一步研究Kif4A在细胞有丝分裂过程中的作用及其调节机制奠定坚实的基础。
参考文献
[1]刘永平，王方海，苏志坚，等.昆虫杆状病毒表达载体系统的研究及应用[J].昆虫知识，2006，43（1）：1-5.
[2]同凌，余黎，白慕群.昆虫杆状病毒表达系统的研究进展与应用[J].微生物学免疫学进展，2014，4（42）：70-78.
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