黄芪—莪术不同提取物抗肿瘤作用研究

材料与方法

1.1 实验药物

氟尿嘧啶注射液（上海旭东海普药业有限公司，批号：FA150205）；注射用环磷酰胺 （CTX，山西普德药业股份有限公司，批号：04141102）；黄芪 （产自甘肃，生产批号：150502），莪术（产自广西，批号：150403），均购买于毫州成源中药饮片有限公司。

1.2 试剂

CCK-8 （日本同仁，批号：FJ692）；细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物，批号：20150528）；NF-κB p65（北京博奥森生物，批号：AE063028）。

1.3 动物与瘤株

昆明种小鼠[（购自北京海淀兴旺实验动物养殖场，雌雄各半，许可证号：SCXK（京）2014-0013）]；HepG2 细胞由山西医科大学细胞生物教研室惠赠；H22细胞由山西省肿瘤医院惠赠。

1.4 仪器

BioTeK酶标仪（美国BioTeK）；Cytomics流式细胞仪（美国BECKMAN，FC 500型）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，RE-6000A型）；离心沉淀机（上海医用分析仪器厂，LXJ-Ⅱ型）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂，101-2-S型）。

1.5 方法

1.5.1 药物提取 称取黄芪-莪术（1∶1）各200 g，粉碎成粗粉。（1）采用95%乙醇对黄芪-莪术中的挥发油以及极性较小的脂溶性成分进行提取。将粗粉加6倍量95% 乙醇，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，浓缩干燥，即得95% 乙醇提取物。（2）采用50%乙醇对黄芪-莪术中的三萜类、皂苷类以及黄酮类等中等极性成分进行提取。方法同（1）。（3）采用水提醇沉法对黄芪-莪术中的粗总多糖进行提取。将两药材加8倍量水，提取3次，合并提取液，浓缩至一定体积后加三倍体积80%乙醇沉，放置过夜，离心，收集沉淀物，干燥，即得水提醇沉提取物。（4）采用水煎煮法对黄芪-莪术混合进行提取。将两药材加8倍量水，提取3次，每次1.0 h，合并提取液，浓缩干燥，即得水煎提取物。

1.5.2 黄芪-莪术不同提取物对HepG2细胞增殖和凋亡的影响 （1）细胞增殖抑制率：收集对数期细胞，离心，去上清，加入37℃預热培养基混匀，用细胞计数板在显微镜下细胞计数，细胞接种浓度为：1.5×105个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，放入37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h，各组给药终浓度分别为：95%乙醇提取物组（800、400、200、100、50 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物组和传统水煎物组（2000、1000、500、250、125 μg/mL），阳性对照组为顺铂 2 μg/mL，每组设3个复孔。在加药后24 h，通过CCK-8法检测每个组的OD450值，分别计算细胞抑制率，每组结果用三个复孔平均值表示。实验重复3次。细胞增殖抑制率=（阴性组OD450-实验组OD450）/（阴性组OD450-空白组OD450）×100%。（2）细胞凋亡率：根据CCK-8的结果选取黄芪-莪术95%乙醇提取物组 （400 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物组和传统水煎物组（2000 μg/mL）进行细胞凋亡检测。取对数期细胞，调整细胞浓度为2×105/mL，接种于6孔板，给药24 h后，1000转/min离心5 min，收集细胞，用1×PBS洗两遍，根据试剂及流式细胞仪器说明检测各组HepG2细胞凋亡情况。

1.5.3 黄芪-莪术不同提取物对小鼠H22荷瘤生长抑制作用 在无菌条件下，将H22小鼠乳白色腹水，按1∶10加入生理盐水，冲打混匀。医用酒精消毒小鼠右上腋窝部位，皮下接种0.2 mL细胞悬液。分为模型组、阳性组、95% 醇提组、50%醇提组、水提醇沉组、传统水煎组共6组，每组10只，雌雄各半。接种24 h后给药，灌胃给药，模型组每天灌等剂量的生理盐水，阳性组给予环磷酰胺（30 mg/kg），隔天腹腔注射。连续灌胃11 d后，称重，在无菌条件下剥离瘤块并称重。肿瘤抑制率=（模型组平均瘤重-实验组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。

1.5.4 免疫组化法检测H22小鼠荷瘤组织中NF-κB p65分子表达情况 将H22荷瘤组织放入4% 的多聚甲醛固定，常规脱水后用石蜡包埋，厚度4 μL连续切片，按照试剂盒的说明完成免疫组织化学染色。用Image Pro-Plus 6.0软件400倍拍摄照片，选择阳性目标染色区域，测量其累积分光密度（IOD Sum）和面积累加值（area Sum），结果用平均积分光密度（mean density）=（IOD Sum）/（area Sum）表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05代表具有统计学差异。

2 结果

2.1 黄芪-莪术四种不同的提取物对HepG2细胞增殖的抑制作用

用CCK-8法检测黄芪-莪术四种不同提取物对HepG2细胞增殖的影响，95%乙醇、50%乙醇、醇沉和水煎提取物最高抑制率分别为89.13%、78.36%、20.38%、18.78%，见表1。

2.2 黄芪-莪术不同提取物对HepG2细胞凋亡的影响

经黄芪-莪术不同提取物处理24 h后的HepG2肝癌细胞，用流式细胞仪检测，95%醇提物、50%醇提物、醇沉物和水煎物组早期凋亡率分别为49.6%、46.2%、10.1%、12.3%。与阴性对照组比，95%醇提物和50%醇提物组能明显诱导HepG2细胞凋亡，见封三图3。

2.3 黄芪-莪术不同提取物体内对H22实体瘤的抑制作用

统计结果显示，黄芪-莪术四个提取物组的平均瘤重低于模型组，与模型组相比均有显著性差异，95%醇提取物组、50%乙醇提取物组、醇沉提取物组、水煎提取物组抑瘤率分别为47.55%、36.12%、29.96%、34.68%，结果见表2。

2.4 各组H22荷瘤组织中NF-κB p65蛋白表达情况

免疫组织化学结果显示，与模型组相比，95%醇提取物组和50%醇提取物组中NF-κB p65蛋白表达水平降低，差异有显著性（P<0.01），醇沉物和水煎物组有降低趋势，但是与模型组相比较差异无统计学意义。见表3、封三图4。

3 讨论

黄芪为补气类代表药物，具有补气固表，利尿脱毒、排脓、敛疮生肌等功效。现代研究表明其主要成分为多糖类、黄酮类、皂苷类以及微量元素和氨基酸等成分[5]。莪术为行气活血类代表药物，具有行气破血，消积止痛的功效，用于癥瘕痞块，瘀血闭经，食积胀痛等症。现代研究表明其主要成分是莪术油[6]。二者的有效成分对某些肿瘤细胞有直接的抑制作用，且在机体整体水平有抑瘤作用，如治疗胃癌、肝癌、妇科肿瘤等方面已发挥初步成效[7-9]。本实验用不同种属来源肝癌细胞人HepG2肝癌细胞和小鼠H22肝癌细胞为研究对象，发现黄芪-莪术95%乙醇提取物、50%乙醇提取物、水提醇沉物和水煎提取物虽然对小鼠肝癌H22荷瘤都有一定抑制作用，但是只有95%乙醇提取物和50%乙醇提取物對人肝癌HepG2细胞有明显抑制作用。

细胞凋亡（apoptosis）是机体细胞一种自发的、有条理的生理代谢过程。细胞凋亡与生物的发育、机体免疫功能稳定以及肿瘤的发生有着密切的联系。肿瘤的发生最主要的原因就是一系列可以诱导细胞凋亡启动的因子（ced基因家族、Caspase基因家族、P53基因等）受到抑制，使细胞凋亡程序不能正常启动从而不能清除癌基因及其产物。所以细胞凋亡激活细胞发生细胞凋亡的程序，特异的杀伤肿瘤细胞，是肿瘤治疗的重要手段。在本实验中发现，四个黄芪-莪术提取中，只有95%乙醇提取物和50%乙醇提取物可以明显诱导人HepG2肝癌细胞凋亡，所以黄芪-莪术95%乙醇提取物和50%乙醇提取物诱导HepG2细胞凋亡是二者抗肿瘤作用机制之一。

NF-κB（nuclear factor-κB）是一种细胞核转录因子，与肿瘤细胞的发生、凋亡、侵袭和转移等密切相关而备受关注。在哺乳动物细胞中常以NF-κB p65与NF-κB p50 结合形成二聚体。NF-κB的激活受广泛的信号调节，其中大多数信号与细胞应激有关[10，11]。静息状态下，NF-κB主要与其抑制因子（I-κBα）结合形成复合体定位于细胞质中。当被淋巴因子、细胞因子、药物等激活后，I-κBα被水解释放出NF-κB，最后转移到细胞核[12]。大多数肿瘤细胞中NF-κB信号通路都处于持续激活状态。激活的NF-κB可以抑制TNF-α、促进VEGF等的表达，从而促进肿瘤细胞生长转移[13]。研究表明[14，15]，黄芪、莪术有抑制胃癌和乳腺癌细胞中NF-κB的表达作用。本文研究发现，与模型组相比，NF-κB p65蛋白的表达量只在95%乙醇提取物和50%乙醇提取物组明显降低 （P<0.01）。提示黄芪-莪术95%乙醇提取物和50%乙醇提取物抗肿瘤作用与有降低NF-κB p65蛋白降低有关。

综上所述，黄芪-莪术95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉和水煎四种提取物均有抑制小鼠H22荷瘤生长的作用，其中只有95%乙醇和50%乙醇提取物有抑制H22荷瘤组织中NF-κB p65蛋白表达和抑制人肝癌HepG2细胞生长及诱导其发生凋亡的作用。

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（收稿日期：2016-12-09）

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