摘要：近年来，CRISPR/Cas9系统经过一系列改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术，目前，该技术已成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑，但是该技术在农作物等植物中的应用还比较受限，且其脱靶效应等问题还有待解决。本文首先简要综述了CRISPR/Cas9系统的发展历程、结构组成和作用机制及其在农作物中的应用，进而综述了近年来探索出的提高CRISPR/Cas9系统靶向编辑效率的方法。最后，对基因组编辑技术在农作物和作物育种上的应用进行了展望。
关键词：CRISPR/Cas9系统；向导RNA；脱靶效应；农作物
中图分类号：S188 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2017）01-0012-04
基因组编辑技术产生于20世纪80年代，在CRISPR/Cas出现之前，科学家们只能通过对庞大的突变体库进行筛选，或通过同源重组途径来对DNA进行编辑。由于细胞发生随机同源重组的效率只有百万分之一，用同源重组方法进行基因编辑耗时长、成本高，因此限制了基因组编辑技术的广泛应用[1-2]。21世纪初，科研人员相继开发出锌指核酸酶（zinc finger nucleases，简称ZFNs）技术和类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-likeeffector nucleases，简称TALENs）技术，基因组编辑技术得到迅速发展[3]。2013年初，《Science》《Nature》《Biotechnology》《Cell》等杂志几乎同时报道了1种不依赖于FokⅠ核酸酶的基因组编辑技术——clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9（CRISPR/Cas9），CRISPR/Cas9技术具有多个选择的靶向基因的位点，可实现多基因编辑，编辑的类型包括基因的定点插入、小片段的缺失、多个位点同时突变、基因定点的插入/缺失indel突变等。与其他靶向编辑技术相比，还具有精确可靠、设计简单、容易操作、成本低廉等优点。CRISPR/Cas9技术突破了基因编辑的瓶颈，为基因编辑提供了一把精确的“手术刀”。该技术从发现至今发展迅速，正在成为基因改造的重要方法。
1 发展简史
1987年日本大阪大学（Osakua University）学者Ishino在研究大肠杆菌碱性磷酸酶基因时，发现该基因附近有1段由简单重复序列组成的特异序列[3]。随后，研究者们在其他物种也发现了类似序列，并给予了各种不同的命名：直接可变重复（direct variable repeat，简称DVR），串联重复（tandem repeat，简称TREP），长串联重复的重复（long tandemly repeated repetitive，简称LTRR），长串串联重复（long clusters of tandem repeats，简称LCTR），间隔穿插直接重复（spacers interspersed direct repeats，简称SPIDR）[4]。Mojica等在2000年提出把类似序列作为重复序列家族的一类成员，并将其命名为规律的短间隔序列（short regularly spaced repeats，简称SRSRs）。2002年，荷兰学者Jansen分析该序列发现：它由长度不一（21～37 bp）的正向重复序列（repeats）与长度类似的间隔序列（spacers）间隔排列而成，并将其命名为成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，简称CRISPRs），并在其附近发现CRISPR相关（CRISPR-associated，简称Cas）基因，分析发现Cas基因表达产物与DNA解螺旋酶及核酸酶具有高度同源性，提示Cas蛋白具有DNA内切酶功能。到了2005年，有3个研究小组发现CRISPR可能与微生物的免疫作用有关。2007年，Barrangou等首次利用试验证明了嗜热链球菌的CRISPR系统直接参与细菌对噬菌体的适应性免疫反应。2012年，Jinek等对细菌的Ⅱ型CRISPR系统进行改造和优化，成功地在体外定点切割了环状质粒DNA和线性寡聚核苷酸片段，并证明将分开作用的crRNA、tracrRNA通过1段linker连接成1条单一向导RNA（single-guide RNA，简称sgRNA），仍然能高效地介导Cas9蛋白对DNA的定点切割。近年来CRISPR/Cas9系统被应用到真核生物中，引起了一场遗传操作的革命性改变。2013年，麻省理工学院张锋团队和哈佛大学Church团队在《Science》杂志上同时发表了CRISPR/Cas9系統在哺乳动物细胞中的应用，多个靶向sgRNAs可以同时对基因组的多个位点进行识别，并通过Cas9作用产生断裂，通过DNA修复系统的不精确修复在多个断裂点周围同时引发突变，从而使之作为一种基因编辑方法投入应用。2014年，Nishimasu等解析了Cas9、sgRNA和DNA复合体的晶体结构，为CRISPR/Cas9技术的进一步改进提供了研究条件[3]。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑，是继ZFNs、TALENs后的第3代基因组编辑技术。该技术已在拟南芥、烟草、高粱和水稻等多个物种中实现了基因组编辑[5]。鉴于此，CRISPR/Cas9技术展现出了广阔的应用前景，并受到众多分子生物学家的青睐，但该技术的脱靶效应是基因靶向过程中受到广泛关注的一个重要问题，因此如何改善和提高基因组编辑效率，同时最大限度降低脱靶风险成为了亟待解决的问题。
2 CRISPR/Cas9的组成、结构及作用机制
CRISPR基因座结构包括5′端的tracrRNA（trans-activating crRNA）基因，中间是一系列Cas蛋白编码基因（包括Cas1、Cas2、Csn2和Cas9等），3′端由启动子区域、大量spacers、repeats顺序构成。CRISPR上游的前导序列启动CRISPR序列的转录，转录产物为precrRNA，接下来precrRNA在Cas9和核酸酶的作用下被剪切为成熟的crRNA，crRNA以碱基互补配对的方式与tracrRNA结合为tracrRNA：crRNA复合体，tracrRNA：crRNA复合体与Cas9核酸酶形成RNA-蛋白质复合体，由crRNA中的特异性序列引导至临近前体间隔序列毗邻基序（protospacer adjacent motif，简称PAM）的靶位点，crRNA中的引导序列与靶位点DNA碱基互补配对结合并启动Cas9核酸酶切割DNA双链，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链，而Cas9的RuvCI结构域剪切非互补链，进而在靶位点产生DNA双链断裂（DNA double strand break，简称DSB），然后利用细胞的非同源性末端连接（non-homologous endjoining，简称NHEJ）或同源重组（homologous recombination，简称HR）修复机制对断裂的DNA进行插入、缺失（Indel）、修复（Repair）或替换（Replacement）。与ZFNs、TALENs相比，CRISPR/Cas9技术的优势是可针对多个基因设计sgRNA并在1次打靶中同时完成多基因编辑。根据Cas9可多位点同时打靶的特点，在待删除片段两端设计sgRNA，1次打靶便可实现片段的定向删除，这一特点可满足基因簇删除、多基因删除、调控区域删除、外源标记基因的大片段删除等的需求[6]。
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