材料作为中药有效成分的给药载体研究奠定基础。
1 材料
S4800型扫描电镜（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度及电位分析仪（英国Malvern公司）；UV-2401PC紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）；optima L-80xp超速冷冻离心机（美国Beckman公司）；BS210S电子天平（德国Sartorius公司）。HeLa细胞购自中国科学院细胞库，胎牛血清、RPMI1640培养基均购自Gibco公司。姜黄素购自成都科龙化工有限公司；正硅酸四乙酯（tetraethoxysilane，TEOS）和十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）购自上海阿拉丁试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 MSN的制备
根据参考文献[11]的方法并加以改进：将0.56 g CTAB置于250 mL圆底烧瓶中，加入150 mL蒸馏水使其完全溶解，然后加入6 mL 2 mol·L-1的NaOH溶液，水浴升温至60 ℃，持续高速搅拌下缓慢滴加6 mL TEOS，并维持恒温高速搅拌2 h后，经抽滤、洗涤后得到白色固体，转入三口烧瓶中，加入150 mL酸性乙醇溶液（乙醇-盐酸4∶1）充分分散后，80 ℃加热回流3 h除去CTAB，再次经抽滤、洗涤后，50 ℃真空干燥，即得MSN。
2.2 Cur-MSN的制备
参照载药介孔纳米粒常用的制备方法[8-13]，分别采用溶剂挥发法以及浸渍离心法，以包封率和载药量为指标，筛选Cur-MSN的最佳制备方法。
溶剂挥发法：取上述MSN粉末40 mg各4份，分别滴加10 mL含有不同浓度Cur的80%乙醇溶液，使药物与载体的质量比分别为1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，水浴超声至MSN完全分散后，室温下继续磁力搅拌，挥去乙醇，得到带有乳光的黄色溶液。
浸渍离心法：取上述MSN粉末40 mg各4份，分别滴加5 mL含有不同浓度Cur的无水乙醇溶液，使药物与载体的质量比分别为1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，水浴超声至MSN完全分散后，确保MSN粉末被溶液完全浸没，于恒温摇床上振摇48 h后，将胶体溶液于15 000 r·min-1离心15 min，沉淀经洗涤后真空干燥，上层清液保留用于包封率和载药量的测定。
与浸渍离心法相比，采用溶剂挥发法制备Cur-MSN可以获得更高的包封率和载药量，见表1；当Cur-MSN比例达到1∶4时，Cur-MSN包封率可达到（75.58±5.37）%。为了兼顾较高的包封率和载药量，因此选择Cur-MSN 1∶4，采用溶剂挥发法进行制备Cur-MSN。
2.3 Cur-MSN包封率和载药量的测定
2.3.1 标准曲线的建立 精密称取Cur对照品，用无水乙醇配置成0.105 0 g·L-1的溶液，得对照品储备液。精密量取储备液适量，分别置于10 mL量瓶中，用0.2% SDS溶液稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为0.526 0，1.052，2.104，4.208，6.312，8.416 mg·L-1工作液，运用紫外分光光度计测定各浓度样品在425 nm检测波长下的吸光度[5]。将吸光度和浓度进行回归，得到回归方程Y=0.137X-0.002，r=0.999 9，表明Cur在0.526 0～8.416 mg·L-1线性关系良好。高、中、低3种浓度的回收率，分别为（102.1±1.36）%，（98.5±3.76）%，（95.9±4.35）%，日内精密度为2.7%，日间精密度为3.6%，符合要求。
2.3.2 包封率和载药量的测定 取制备好的Cur-MSN溶液，于15 000 r·min-1离心15 min，收集上清液，沉淀加入等量0.2% SDS溶液洗涤2次，与上清液合并，精密吸取适量合并液，用0.2% SDS溶液稀释后，按照2.3.1项下方法测定Cur含量（W1）；沉淀干燥后称重（W2）；Cur初始投入量记为W3。根据下列公式计算包封率（encapsulation efficiency，EE）和载药量（load efficiency，LE）。
EE=（W3-W1）/W3×100%
LE=（W3-W1）/W2×100%
2.4 Cur-MSN优化制备工艺
通过上述条件优化，确定了Cur-MSN的制备工艺：取MSN粉末40 mg，逐滴加入10 mL含有10 mg Cur的80%乙醇溶液，水浴超声将MSN完全分散后，室温下继续磁力搅拌，挥去乙醇，得到带有乳光的黄色溶液，即得Cur-MSN溶液。取适量Cur-MSN溶液，用蒸馏水数倍稀释后，激光粒度及电位分析仪测定Cur-MSN的粒径和Zeta电位。所得Cur-MSN的平均粒径为75.8 nm，PDI为0.281，Zeta电位为-30.1 mV，见图1。
2.5 扫描电镜观察Cur-MSN的形态
取适量Cur-MSN样品溶液，用无水乙醇充分稀释并超声使其均匀分散，随后将样品溶液滴于样品平台上，用导电胶固定后喷金。电压加至5 kV，扫描电镜观察样品外观形貌、分散性和均匀性。Cur-MSN的外观为球形，大小均一，纳米粒表面仍清晰可见细小的介孔，见图2。
2.6 3批Cur-MSN包封率和载药量
制备了3批Cur-MSN，经计算，Cur-MSN的平均包封率为（72.55±2.01）%，载药量为（16.21±1.12）%，见表2。
2.7 Cur-MSN体外释药
将Cur-MSN适当稀释后，精密吸取1 mL（含Cur约1.0 mg）转入预处理好的透析袋内（截留相对分子质量为3 500）；另取1 mL Cur原药储备液（含Cur约1.0 mg）亦转入预处理好的透析袋内，密封后分别置于将透析袋放入盛有200 mL 0.2% SDS溶液的烧杯中，于37 ℃恒温水浴振荡。分别于0.5，1，2，4，6，12，24，48，72，96 h取透析液1 mL，同时补充等量的释放介质。平行重复3次。按照2.3项下方法测定Cur的含量，计算累计释放率。Cur原药在6 h内基本完全释放，Cur-MSN在前6 h有突释现象，应该是纳米粒溶液中未包载及部分吸附在纳米粒表面的Cur造成的，此后Cur-MSN展示了明显的缓释特征，96 h释放了83.5%，见图3。
2.8 Cur-MSN体外抗肿瘤活性研究
HeLa细胞采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，于37 ℃的二氧化碳（5%）培养箱中培养。取对数生长期的HeLa细胞，胰酶消化后制成1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中。贴壁生长24 h后，分别加入适量的Cur以及Cur-MSN贮备液（Cur用DMSO溶解制备贮备液，然后用培养基稀释到最终浓度[14]），使其终浓度分别为0.1，0.5，1，2，5，10，20，40 mg·L-1（均按Cur计算），继续培养24 h，PBS洗涤细胞3次，加入20 μL 0.5%MTT溶液及100 μL，3～4 h后小心吸出孔内溶液，加入150 DMSO溶解底部结晶，于酶标仪570 nm测定各孔A，比较Cur和Cur-MSN的抗肿瘤活性。Cur与Cur-MSN对HeLa细胞的杀伤作用均呈现浓度依赖性，但两者的杀伤作用相近，经计算IC50分别为18.41，19.40 mg·L-1，说明将Cur包载于MSN内，形成的Cur-MSN同样具有较强的体外抗肿瘤活性，为后期的体内研究奠定了基础，见图4。
3 讨论
本研究首次报道了运用MSN为载体包载Cur原药，制备得到的Cur-MSN解决了Cur水溶性差的缺点，并利用MSN易于被细胞吞噬的性质，达到良好的抗肿瘤目的。传统有机高分子纳米粒在载带中药有效成分时，普遍存在载药量小不能达到有效剂量、对药物性质要求高的问题，而无机MSN具有载药量大、对药物无选择性的特点，对于中药有效成分载药具有明显优势。但目前关于MSN纳米粒载药报道多局限在化学药物类，对中药有效成分的载药报道鲜见，而化学药物与中药有效成分在用药剂量、药物性质等方面均有明显差异，因此，研究MSN对中药类的载药性质，具有重要意义。本研究对MSN载带姜黄素的性质考察，将为MSN进一步推广应用于中药类载药奠定基础。
据文献报道，MSN载药常用的方法有溶剂挥发法和浸渍离心法。实验发现浸渍离心法虽然操作方便，相对省时，但是制备的纳米粒包封率较低，这与徐爱仁等[12]报道不一致，分析原因可能与Cur的溶解性有关，水不溶性药物包载于MSN时，选择溶剂挥发法可获得更高的包封率。且本法工艺简便，可有效避免在制备过程中姜黄素的降解。
Cur是生物活性物质，同时也是不稳定、易降解的物质。研究表明，Cur在弱酸性及碱性条件下易水解，表面活性剂能有效降低Cur的水解，其中SDS对Cur溶液的稳定作用最强[15]；加之Cur在水中的溶解度极低（<0.3 mg·L-1），Cur在SDS溶液中的溶解度能大幅提升，因此，为了确保在释放试验中达到漏槽条件并维持Cur的稳定性，选择0.2% SDS水溶液作为溶出介质。同时，由于Cur对光照亦敏感，因此长时间体外释放实验建议避光进行。
本研究所制备的MSN载体为无机疏水性材料制成，对低水溶性药物姜黄素有强吸附性，可作为姜黄素的优良贮库。研究证实，MSN易于富集于肝脏和脾脏[16]，是一种有潜力的肝靶向载体；另外，通过MSN表面硅醇基嫁接各种官能团可以很容易的进行表面改性处理，例如进行pH敏感、还原响应性基团修饰，从而达到肿瘤微环境响应性，更好地定位于肿瘤组织，且表面改性后不会破坏其高度有序性及介孔结构[17]。后续研究中，将着重考察Cur-MSN及其表面修饰产物在动物体内的组织分布及肿瘤靶向性。
[参考文献]
[1] Babaei E， Sadeghizadeh M， Hassan Z M， et al. Dendrosomal curcumin significantly suppresses cancer cell proliferation in vitro and in vivo[J]. Int Immunopharmacol， 2012， 12（1）： 226.
[2] Cai X Z， Wang J， Li X D， et al.Curcumin suppresses proliferation and invasion in human gastric cancer cells by dowegulation of PAK1 activity and cyclin D1 expression[J]. Cancer Biol Ther， 2009， 8（14）： 1360.
[3] 张李巧， 栾立标， 吴炎， 等. 姜黄素CTPP-PEG-PCL 胶束的制备及体外评价[J]. 中国中药杂志， 2013， 38 （13）： 2109.
[4] Yallapu M M， Jaggi M， Chauhan S C. Beta-cyclodextrin-curcumin self-assembly enhances curcumin delivery in prostate cancer cells [J]. Colloids Surf B， 2010， 79（1）： 113.
[5] Matloob A H， Mourtas S， Klepetsanis P， et al. Increasing the stability of curcumin in serum with liposomes or hybrid drug-in-cyclodextrin-in-liposome systems： a comparative study [J]. Int J Pharm， 2014， 476（1/2）：108.
[6] Tang H， Murphy C J， Zhang B， et al. Amphiphilic curcumin conjugate-forming nanoparticles as anticancer prodrug and drug carriers： in vitro and in vivo effects [J]. Nanomedicine， 2010， 5（6）： 855.
[7] 张军， 郭卫， 翟光喜. 姜黄素剂型的研究概况[J]. 食品与药品， 2010， 12（3）： 133.
[8] Wang Y， Zhao Q， Han N， et al. Mesoporous silica nanoparticles in drug delivery and biomedical applications [J]. Nanomedicine， 2015， 11（2）： 313.
[9] Park S B， Joo Y H，Kim H， et al. Biodegradation-tunable mesoporous silica nanorods for controlled drug delivery [J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl， 2015， 50（1）： 64.
[10] Xu W， Riikonen J， Lehto V P. Mesoporous systems for poorly soluble drugs[J]. Int J Pharm， 2013， 453（1）： 181.
[11] 王彦竹，孙立章，宋爱华， 等. 介孔二氧化硅纳米粒的制备及对载药与药物溶出度的影响[J]. 沈阳药科大学学报， 2012， 29（4）： 258.
[12] 徐爱仁，陈晶晶，马卫成， 等. 载阿霉素介孔二氧化硅纳米粒的细胞毒性及细胞摄取[J]. 沈阳药科大学学报， 2012， 29 （12）： 913.
[13] 王彦竹， 赵勤富， 孙清， 等. 两种介孔二氧化硅载体用于改善西洛他唑溶出度的比较[J]. 沈阳药科大学学报， 2014， 31（1）： 1.
[14] 贾淑杰， 刘庆焕， 王文彤， 等. 姜黄素、去甲氧基姜黄素和二去甲氧基姜黄素对照品的制备及姜黄素细胞毒性初步研究[J]. 中草药， 2012， 43（6）： 1118.
[15] 韩刚， 霍文， 李秋影， 等. 姜黄素的稳定性研究[J]. 中成药， 2007， 29（2）： 291.
[16] 肖正林， 刘珍宝， 王婷， 等. 介孔二氧化硅纳米粒介导的药物传递系统及其生物安全性的研究进展[J]. 中国医药工业杂志， 2013， 44（1）： 81.
[17] 胡延臣， 王彦竹， 王思玲. 纳米多孔二氧化硅作为药物载体的研究进展[J]. 沈阳药科大学学报， 2010，27（12）：961.
[责任编辑 孔晶晶]
推荐访问： 姜黄 制备 体外 纳米 活性
