解毒通络注射液对缺血再灌注大鼠脑水肿的防治作用

材料

1.1 动物 雄性SD大鼠，体重250～270 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2002-2003。

1.2 药品与试剂 解毒通络注射液由北京中医药大学中药学院中药制剂系杜守颖教授提供；阳性对照药尼莫地平注射液（德国拜耳公司）；多聚甲醛（北京化学试剂公司）；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠ICAM-1，VCAM-1，E-selectin定量酶联检测试剂盒（北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；兔MMP-9多克隆抗体、SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 仪器 外科手术灯（上海医疗器械五厂）；钓鱼尼龙线（直径0.285 mm）；AX205型天平（梅特勒公司）；Orbital shaker气浴摇床（生命科学公司）；400 R低温离心机（德国Heraeus）；722型可见光分光光度计（上海第三分析仪器厂）；Multiskan MK3型酶标仪（芬兰Thermo Labsystem公司）；DU640型紫外线分光光度计（德国BACKMAN公司）；真空组织脱水仪、平推式石蜡切片机（日本）；真彩色图像分析仪（德国Leica公司）；Olympus显微镜（日本）。

2 方法

2.1 分组及给药 大鼠随机分为假手术组、模型组、解毒通络注射液高、中、低剂量组（4，2，1 mL·kg^-1）、尼莫地平组（0.4 mg·kg^-1）。采用舌下静脉注射给药，假手术组及模型组注射等量生理盐水，于插线成功15 min注射给药。

2.2 大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型制备 参照Koizumi^[3]与Nagasawa^[4]方法略加改进制作暂时性大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。大鼠麻醉，仰卧位固定。分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，穿线备用，结扎颈外动脉与颈总动脉，以动脉夹夹闭颈内动脉远心端后，于颈外动脉与颈内动脉分叉处作一切口，从切口处插入头端磨成球形的光滑尼龙线（直径0.285 mm，距头端18 mm处作标记），有阻力感时停止进线并记录缺血时间，插入深度18 mm左右，造成大脑中动脉阻塞。结扎切口处，缝合皮肤。2 h后将尼龙线轻轻抽到近切口处，实现再灌注。假手术组只结扎右侧颈总动脉。脑缺血及再灌注过程中保持室温25 ℃。

2.3 脑含水量测定 再灌注24 h断头取脑，左右半脑分开，用滤纸吸干表面水分，分别称量左右脑湿重，105 ℃烘烤48 h至恒重，精确称量干重，脑水含量=（湿重-干重）/湿重×100%。

2.4 解毒通络注射液对MCAO大鼠血脑屏障的影响 再灌注3.5 h后以2.5%伊文思蓝生理盐水溶液2 mL·kg^-1舌下静脉注入，0.5 h后大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉（3.5 mL·kg^-1体重），常规胸腹联合切口，经左心室插管，生理盐水灌注，直到流出清亮液体，断头取脑（左右脑分开），去除表面血凝块，称重，置于甲酰氨5 mL中24 h，用分光光度计（波长620 nm）比色，记录吸光度A。以测得A为X轴，每5 mL溶液伊文思蓝含量为Y轴作出标准曲线回归方程。将所得A代入标准曲线回归方程，计算EB量，再除以脑湿重求得伊文思蓝含量（μg·g^-1脑湿重）。

2.5 ICAM-1，VCAM-1，E-selectin的测定 分别于缺血2 h再灌24 h后断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，然后将患侧大脑半球在4 ℃下以生理盐水制成20%组织匀浆，-20 ℃冻存待测。测定时，冰浴中融化，置1.5 mL离心管中，4 ℃，3 000 r·min^-1离心20 min，吸取上清液按照试剂盒操作说明书进行ICAM-1，VCAM-1，E-selectin含量测定，结果以每毫克蛋白所含细胞因子纳克数来表示。

2.6 解毒通络注射液对MCAO大鼠MMP-9表达的影响 于再灌注24 h后，麻醉后常规胸腹联合切口，经左心室插管，分别用生理盐水、4%多聚甲醛的0.1 mol·L^-1磷酸盐缓冲液灌注固定，断头取脑，浸于4%多聚甲醛溶液内固定72 h后，自视交叉处开始向后取冠状切片，石蜡包埋，在切片机上连续切片，片厚6 μm，60 ℃烘烤12 h。MMP免疫组织化学染色按SABC免疫组化试剂盒说明书步骤操作，其中以已知的阳性片染色作为阳性对照，阴性对照片用PBS代替一抗，其余步骤相同。每张切片在光镜下（×400）分别选取3个视野，采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统进行分析，每张切片在缺血区域选取同一部位随机摄取3个视域，统计每个视域的积分吸光度（图像分析时在相同的背底灰度下进行，以保证结果的可比性）。

2.7 统计方法 采用SPSS 11.5软件做统计分析，各组实验数据以±s表示，组间差异比较用One-Way ANOVA分析统计。

3 结果

3.1 对大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型脑含水量和脑微血管伊文思蓝（EB）通透性的测定 缺血2 h再灌24 h后，与假手术组比较，模型组缺血侧脑水含量明显增高（P<0.01）；与模型组比较，解毒通络注射液2，4 mL·kg^-1和尼莫地平0.4 mg·kg^-1能显著降低MCAO大鼠缺血侧脑水含量（P<0.05或P<0.01），改善脑水肿。缺血2 h，再灌注4 h后，与假手术组比较，模型组缺血侧脑微血管对伊文思蓝的通透性明显增高（P<0.01）；与模型组比较，解毒通络注射液2，4 mL·kg^-1和尼莫地平0.4 mg·kg^-1均明显降低MCAO大鼠右脑伊文思蓝含量（P<0.05或P<0.01），见表1。

3.2 对大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型ICAM-1，VCAM-1，E-selectin的测定 缺血2 h再灌24 h后，与假手术组比较，模型组脑组织细胞因子ICAM-1，VCAM-1，E-selectin水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，解毒通络注射液2，4 mL·kg^-1和尼莫地平组均明显降低MCAO大鼠ICAM-1，VCAM-1，E-selectin含量（P<0.05或P<0.01），见表2。

3.3 对大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型MMP-9表达的影响 免疫组化染色结果表明，MMP-9阳性部位主要表达在微血管内皮细胞，也见于浸润的白细胞，与假手术组比较，模型组积分吸光度明显增加（P<0.01）；与模型组比较，解毒通络注射液3个剂量组和尼莫地平0.4 mg·kg^-1能够显著降低单位视域内MMP-9的积分吸光度（P<0.05或P<0.01），见表3。

4 讨论

脑水肿是缺血性中风的主要并发症，也是临床上患者发病以后引起死亡的主要原因。脑缺血再灌注损伤引起毛细血管被损伤，内皮细胞发生肿胀、坏死或内皮细胞紧密连接开放、穿内皮隧道形成、胞饮现象增强、胶质细胞及其足突受损，血脑屏障（BBB）功能损害，导致血管通透性增加，脑组织含水量明显增加，脑水肿症状明显，对正常血压大鼠MCAO模型观察发现BBB的进行性破坏出现于6 h后^[5]。若血管再通，则15 min后BBB首次开放，5 h和72 h再次开放^[6]。正常生理状态下，伊文思蓝（EB）进入血中与血浆蛋白紧密结合，不易透过血脑屏障。血脑屏障损伤后，结合有EB的血浆蛋白可外渗进入脑组织，使脑组织中EB含量增加。本实验以比色法观察了脑缺血2 h再灌注4 h微血管对EB的通透性的影响，结果显示，解毒通络注射液2，4 mL·kg^-1能够降低MCAO大鼠脑微血管通透性，EB含量明显降低。此外，在EB的通透性实验中，采用心室灌流的方法，避免了断头法血管内血液淤积所导致的伊文思蓝含量的升高，比较客观地反映了血脑屏障通透性的变化。本实验以干-湿重法、比色法观察了脑缺血再灌注大鼠脑含水量和血脑屏障通透性，结果表明解毒通络注射液能明显减轻脑水肿、降低血脑屏障通透性，显示出一定的脑保护作用。

黏附分子是一类能介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互黏附的糖蛋白，临床和实验研究表明黏附分子在脑缺血再灌注损伤引起的炎症和免疫反应等过程中起着非常重要的作用[ 7-8]。血液中的白细胞通过与血管内皮细胞的黏附而外渗是起动炎症反应的关键步骤，而白细胞在血管内皮细胞上滚动、结合及跨内皮细胞转运等过程均需黏附分子的参与。白细胞与内皮细胞黏附的起始阶段由选择素介导，由CD11/CD18复合物（β2整合素）与ICAM-1形成更为紧密的结合，随后穿越内皮细胞进入血管周围的基质，导致白细胞浸润^[9-10]。白细胞（单核细胞或巨噬细胞）可阻塞血管腔，减少血流量；进到血管外的白细胞还可释放自由基、蛋白水解酶及其他毒性物质，引起血管损伤^[11]。本实验中解毒通络注射液能减少模型大鼠脑组织ICAM-1，VCAM-1，E-selectin的表达，在缺血再灌注损伤早期阶段，减轻中性白细胞黏附于缺血梗死区血管内皮细胞而阻塞毛细血管，减少细胞间黏附分子和选择素的分泌，抑制中性白细胞在血管内皮细胞上滚动，改善机械性阻塞微循环，增加脑组织血液供应，改善脑血管损伤，保护血脑屏障，减轻脑组织水肿，减轻炎症反应，从而达到保护脑缺血再灌注损伤的目的。

基质金属蛋白酶（MMPs）是一组降解细胞外基质蛋白的锌依赖蛋白酶，能选择性作用于多种细胞外基质蛋白而成为研究热点^[12]，在基底膜降解中起着主要作用。缺血后脑组织MMP-9活性增高是缺血早期BBB损伤加重缺血性脑损伤的重要机制之一。Rosenberg等^[13]用酶谱法测定缺血后MMPs的表达，缺血后12 h MMP-9活性开始增高，24，48 h到达高峰，持续表达5 d，与缺血早期BBB通透性增加密切相关，其中MMP-9活性增加，引起细胞外基质蛋白降解，加重缺血性脑损伤和脑水肿^[14]。Romanic等^[15]应用MMP-9抑制剂能明显减少缺血引起脑水肿和脑梗死体积，减轻BBB损伤，提示缺血性BBB开放和脑水肿与MMP-9活性增高有关。本研究发现，假手术组未见明显阳性着色，造模后MMP-9阳性部位主要表达在微血管内皮细胞，也见于浸润的白细胞。模型组阳性表达积分吸光度明显增加，解毒通络注射液能够显著降低单位视域内MMP-9的积分吸光度，可减轻模型大鼠缺血再灌注损伤引起的BBB损伤，可能是解毒通络注射液减轻脑水肿的重要机制之一。

解毒通络注射液对脑缺血再灌注后血脑屏障破坏、脑水肿具有较为明显的对抗作用，通过抑制ICAM-1，VCAM-1及E-selectin的表达，抑制MMP-9的表达可能是其主要的作用机制。

[参考文献]

[1] 邹忆怀.“毒损脑络”学说的症状学研究思路探讨[J].中医脑病杂志，2006，2（2）：67.

[2] 杨鸿，赵宜军，王永炎.解毒通络注射液对MCAO大鼠脑组织炎性细胞因子的影响[J].中国中药杂志，2008，33（23）：2817.

[3] Koizumi J， Yoshida Y， Nakazawa T， et al. Experimental studies of ischemia brain edema，Ⅰ： a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jpn J Stroke，1986， 8：1.

[4] Nagasawa H， Kogure K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke， 1989， 20（8）：1037.

[5] Betz A L， Coester H C. Effect of steroids on edema and sodium uptake of the brain during focal ischemia in rats[J].Stroke，1990，21（8）：1199.

[6] Kuroiwa T，Ting P，Martinez H，et al.The biphasic opening of the blood-brain barrier to proteins following temporary middle cerebral artery occlusion[J].Acta Neuropathol，1985，68（2）：122.

[7] Simundic A M， Basic V， Topice E， et al. Soluble adhesion molecules in acute ischemic stroke[J].Clin Invest Med，2004，27（2）：86.

[8] Storini C， Rossi E， Marrella V， et al.C1-inhibitor protects against brain ischemia-reperfusion injury via inhibition of cell recruitment and inflammation[J]. Neurobiol Dis，2005，19（1/2）：10.

[9] Maroszynska I， Fiedor P. Leukocytes and endothelium interaction as rate limiting step in the inflammatory response and a key factor in the ischemia-reperfusion injury[J].Ann Transplant，2000， 5（4）：5.

[10] Sneddon A A， Mcleod E， Wahle K W， et al. Cytokine-induced monocyte adhesion to endothelial cells involves platelet-activating factor：suppression by conjugated linoleic acid[J].Biochmi Biophys Acta，2006，1761（7）：793.

[11] Frijns C J， Kappelle L J. Inflammatory cell adhesion molecules in ischemic cerebrovascular disease[J].Stroke， 2002，33：2115.

[12] Grossetete M， Phelps J， Arko L， et al. Elevation of matrix metalloproteinases 3 and 9 in cerebrospinal fluid and blood in patients with severe traumatic brain injury[J].Neuro Surg，2009，65（4）：702.

[13] Rosenberg G A， Navratil M， Barone F， et al. Proteolytic cascade enzymes increase in focal cerebral ischemia in rat[J].Cereb Blood Flow Metab，1996，16：360.

[14] Rosenberg G A， Estrada E Y， Dencoff J E.Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood brain barrier opening after reperfusion in rat brain[J].Stroke，1998，29：2189.

[15] Romanic A M， White R F， Arleth A J， et al. Matrix metalloproteinases expression increases after cerebral focal ischemia in rats[J].Stroke，1998，29：1020.

Protective effect of Jiedu Tongluo injection on cerebral edema in rats with

lesion of cerebral ischemia/reperfusion

WU Li-fei XING Yue GUAN Ya-lan LIU Zhen-quan ZHANG Wen-sheng²

（1.Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. Institute of Natural Medicine and Chinese Medicine Resources， College of Resource Science &

Technology， Beijing Normal University， Beijing 100875， China）

[Abstract] Objective： To investigate the protective effects of Jiedu Tongluo injection on cerebral edema induced by focal lesion of cerebral ischemia/reperfusion， the hydrous content of brain and the expressions of intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1），vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1），E-selectin and MMP-9 in rats. Method： The model of brain middle cerebral artery ischemia/reperfusion was established by the thread approach. After 24 hours of reperfusion， cerebral edema formation was determined by the hydrous content of brain. The permeability of blood brain barrier was evaluated based on the leakage of Evans blue. Enzyme-linked immunoadsordent assay （ELISA）was used to examine the expression of ICAM-1， VCAM-1， E-selectin. The expression of MMP-9 was measured by immunohistochemistry. Result： JDTL， in the dose of 2 mL·kg^-1 and 4 mL·kg^-1，relieved cerebral edema（P<0.05， P<0.01）， reduced the expressions of ICAM-1， VCAM-1and E-selectin and decreased MMP-9 activity（P<0.05， P<0.01）in model rats. Conclusion： Jiedu Tongluo injection has a protective effect on rat brain from cerebral edema induced by the injury of focal cerebral ischemia/reperfusion. The mechanism is related to that Jiedu Tongluo injection can reduce the expressions of ICAM-1， VCAM-1 and E-selectin and inhibit of MMP-9 activation in rat brain.

[Key words] Jiedu Tongluo injection； cerebral edema； intercellular adhesion molecule-1； vascular cell adhesion molecule-1； E-selectin； matrix metallo proteinase-9； rats

doi：10.4268/cjcmm20140626

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