【摘要】 目的 应用基因芯片技术分析人高、低转移肺巨细胞癌细胞株的基因差异表达谱，筛选与肺癌转移相关基因。方法 提取人高转移肺巨细胞株95D和人低转移肺巨细胞株95C的mRNA，通过逆转录，制备分别用cy5—dUTP和cy3—dUTP进行标记的cDNA探针，并与芯片杂交。经过Scan Array 3000扫描仪扫描，获取图象及对杂交信号进行数据分析，筛选出95D和95C细胞表达差异的基因谱,并对其中部分基因进行RT—PCR分析、验证。
结果 在所检测95C和95D细胞中，466条基因有表达差异，其中具有同一Genebank量的有108对，上调基因47对，下调基因61对。对其中KIAA1108、PGR1、JWA、S182、Jab1 部分差异表达基因，经RT—PCR 技术验证，结果与基因芯片基本符合。结论 肺癌转移过程与多种基因作用有关，基因芯片技术可为肺癌转移相关基因的筛选，提供有效方法。
【关键词】 肺肿瘤; 基因筛选;肿瘤转移；逆转录—聚合酶链反应
肺癌仍然被认为是工业化国家癌症相关死亡的主要原因，尽管癌症的诊断和治疗不断发展，但目前的5年生存率14%仅稍高于60年代的8%［1］，预防和早期诊断无疑很重要。因此，肿瘤发生和转移的靶点成为目前研究的焦点。肿瘤的浸润和转移是决定肿瘤病人预后的一个关键因素。肿瘤的转移是一系列肿瘤—宿主相互作用一系列复杂过程的结果［2］。利用基因芯片从分子水平探索肺癌转移相关基因，对防治肺癌的转移具有积极的指导意义。
1 材料和方法
1.1 细胞株
所用的细胞株为人肺巨细胞癌细胞株95D及95C［3,4］（由解放军总医院病理科陈乐真教授惠赠），系源于人肺巨细胞癌母系细胞（PLA—801）中分出并建成的亚系。两者为共源细胞株，具有相同的遗传背景。其中95D细胞株具有自发性高转移生物学特性，而95C细胞株具有不转移（或低转移）生物学特性。
1.2 主要试剂
RPMI Medium 1640培养基、TRIZOL Reagengt、RT—PCR第一链合成试剂盒(SuperScript First—Strand Synthesis System for RT—PCR)均购自美国Invitrogen公司。优级小牛血清购自美国Hyclone公司。DEPC、胰蛋白酶购自美国Sigma公司。琼脂糖购自美国Promega公司，LA Taq酶，dNTP Mixture, 100 bp DNA Ladder Marker均购于宝生物工程有限公司（TaKaRa），引物由北京奥科生物公司合成。溴化乙锭购自北京鼎国生物公司，异丙醇、氯仿及乙醇购自北京试剂公司。
1.3 芯片
人类基因芯片（H80d）购自上海博星基因芯片公司（Biostar Genechip Inc , Shanghai），该芯片为cDNA芯片，芯片包含了被检测的16396条有效基因。
1.4 细胞培养
用RPMI Medium 1640培养基及10％优级小牛血清在37℃、5％CO2条件下，进行培养及传代。
1.5 总RNA提取、测定
应用Trizol一步法提取细胞总RNA，以紫外分光光度计测定总RNA浓度及A260nm/280nm；完整性用含溴化乙锭的1.2％琼脂糖电泳鉴定。
1.6 探针制备 应用mRNA柱纯化试剂盒纯化各样品的mRNA并反转录成cDNA,以Cy3—dUTP标记95C细胞cDNA，Cy5—dUTP标记95D细胞cDNA，乙醇固定后，将两种标记的探针混合、溶解于20μl 5×SSC+0.2%SDS杂交液中。1.7 芯片杂交 将探针加在预杂交好的基因芯片上，盖玻片封片，置于杂交舱中，42℃杂交15—20h,然后洗涤室温凉干。
1.8 检测与分析 用Scan Array 3000扫描仪扫描芯片,获取基因表达的信号强度值,用预先选定的内参照基因对获取的原始信号进行均衡和修正。用ImaGene3.0软件分析和两种荧光信号的强度和比值。按以下3个条件作为差异表达的标准：(1）Cy5/ Cy3的自然对数的绝对值>0.69(Cy3和Cy5信号相差2倍以上,Ratio 值＞2.0或＜0.5)；(2）Cy3或Cy5、Cy3 和Cy5信号值其中之一必须>800；(3)PCR结果良好。
1.9 半定量RT—PCR (1）取3μg总RNA，严格按照试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。（2）根据基因库中的基因序列，分别针对基因芯片结果中有差异表达的基因：KIAA1108、PGR1、JWA、S182、Jab1合成PCR引物（表1）。（3）根据引物扩增，反应条件为：94℃预变性 5min, 94℃变性 60s,退火温度详见表1，时间45s，72℃延伸1min, 共25个循环后72℃再延伸10min。（4）扩增产物于含有0.5mg/L溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统在紫外线下摄取电泳图谱并应用核酸定量分析软件Quantity One（Bio—RAD）进行分析。（5）以看家基因β—actin的表达为内对照，用扩增基因/β—actin的灰度比值对该基因的表达进行半定量。
2 结 果
2.1 总RNA特征 波长260nm和280nm吸光度的比值为1.693,电泳结果证实28s、18s条带无明显降解。
2.2 基因芯片杂交结果 此次所得均一化系数为0.941，将均一化系数和cy3值相乘，获得调整后的cy3*值。cy5/cy3*比值<0.5为表达下调，>2.0为表达上调。Cy3与Cy5扫描结果经计算机数据叠加后得到图1所示图像。由于cy3荧光信号和cy5荧光信号分别以绿色和红色表示，因此，对于某一点的两种叠加荧光信号，如果cy3信号较强，该点多显绿色(呈下调趋势) 代表该基因在95C细胞株中高表达,而在95D细胞株中低表达；如果cy5信号较强，该点多显红色(呈上调趋势) 代表该基因在95C细胞株中低表达,而在95D细胞株中高表达；如果强度相似，即显示黄色。该图反映了芯片上每条基因在两株细胞中表达丰度的差异。
2.3 基因芯片杂交信号散点 如图2所示, X轴以cy3荧光强度值为坐标，Y轴以cy5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号。数据点若为红色，则代表Y与X的比值在0.5—2.0之间，基本属非差异表达。数据点为黄色，则代表Y值与X值的比值在0.5—2.0范围之外，说明在表达芯片上的信号差异表达量大于2倍(很可能是有表达差异的数据)。
2.4 对差异表达基因的初步分析 在被检测的16 396条有效基因中，出现表达差异的基因有466条，其中上调基因168条，下调基因298条，其中具有同一Genbank ID号的Double基因共108对，上调基因47对，下调基因61对。这些基因在与两种探针杂交时表现出一定的差异，且上下调趋势一致。
2.5 RT—PCR 从基因芯片显示的差异表达基因中，选择了部分基因（表2）如：KIAA1108、PGR1、JWA、S182、Jab1进行RT—PCR进一步验证分析，结果显示(图3)：JWA、S182和Jab1基因在95D细胞中高表达，KIAA1108、 PGR1基因在95D细胞中低表达，与表达谱芯片的结果相符合。
3 讨 论
随着分子生物学的发展，目前肿瘤病因、发病机制的研究已经进入基因水平，认为肿瘤的发生、发展是多种肿瘤相关基因（包括癌基因，抑癌基因及肿瘤转移相关基因）表达失常。参与肿瘤转移调控的基因达数百种，但有关这些基因的检测多限于一种或几种基因的表达［5，6］，不能全面反映各基因间的关系。基因芯片具有高通量、高度并行性和敏感性的优势［7］，比较差异基因表达谱，能从基因水平实时反映肿瘤生长调节等信息，了解表现型和基因型的相互关系。因而本研究利用基因芯片的特性进行平行对照的实验设计［8］，选用了遗传背景相同但转移能力不同的人肺巨细胞癌细胞株为研究对象，避免了标本取样的组织学差异，以使所筛选出的各基因间的关系更全面、准确。
我们应用基因芯片发现，在人高转移和低转移肺巨细胞癌细胞株之间出现表达差异的基因有466条，其中具有同一GenBank ID号的Double基因共有108对，其中上调基因47对，下调基因61对。且基因表达谱异主要集中在细胞信号传导蛋白，代谢及蛋白翻译合成相关基因方面。在差异表达中，作者对KIAA1108、 PGR1、JWA、S182和Jab1基因进行了RT—PCR的鉴定、分析，结果显示与基因芯片的检测结果一致。由此进一步验证了基因芯片结果的可靠性。
在基因芯片中下调基因KIAA1108（GenBank登录号AB029031），它在一项从自体内脑组织的100条新的cDNA克隆完整的序列，其编码的蛋白具有TBC (Tre—2/Bub2/Cdc16)区域功能，即细胞信号传递［8］,可以调节细胞周期及Rab的GTP激酶活化蛋白的功能。G蛋白是一个种类繁多、可与GTP结合而且活性受到GTP调控的超家族。在调节细胞增殖、细胞凋亡、恶性肿瘤细胞的浸润和转移等方面发挥重要作用。Rab蛋白属G蛋白,在与GTP结合状态下,它能与下游的多种效应蛋白相结合。有研究证明PARIS—1包含TBC区,且在前列腺癌中起着调节细胞分化、生长作用［9］。而癌基因TRE17是TBC家族中的重要成员,在人类各种肿瘤细胞中均有持续转录，其过表达促进肿瘤发生［10］。以上研究说明TBC区与肿瘤的发生、转移有密切关系。但本研究芯片结果显示KIAA1108表达在高转移人肺巨细胞癌细胞株中下调，这可能是肿瘤类别不同或其它原因所致，尚待更深入的研究来论证。
另外一个下调基因PGR1（GenBank登录号AF116272）也称PAM14,其编码产物为 T细胞激活蛋白，也是MRG相关蛋白。PAM14已经被证明是与MORF4/MRG复合物家族相关蛋白，和Rb一样都是抑癌蛋白。通过动物实验，了解到PAM14可能作为衔接蛋白在核蛋白复合体中起作用，也可能是另一种功能冗长蛋白的补偿［11］。在恶性间皮瘤、肺腺癌、未肿瘤肺DNA甲基化的研究对比中，显示在恶性间皮瘤、腺癌细胞株PGR1甲基化均比非肿瘤肺组织明显升高［12］。PGR1基因在高、低转移人肺巨细胞癌细胞株中表达差异,说明此基因编码蛋白不仅与肿瘤甚至是肺腺癌发生有关，而且其杂交信号下调，说明在高转移肺巨细胞株抑制因素减弱，使肿瘤细胞具有了更高的转移能力。
上调基因中基因Jab1（GenBank登录号 HSU65928）表达差异较为明显，它可与c—jun蛋白N端激活区结合。它可直接与细胞周期素依赖的激酶抑制因子（p27Kipl）结合并特异地诱导其下调。Jab1在卵巢癌表达时发现，其表达与细胞恶性程度正相关，Jab1和p27Kipl表达呈负相关，Jab1是p27Kipl负相调节因子，可能与卵巢肿瘤的发展和预后有关［13］。Jab1和p27Kipl相互作用，在对酪氨酸激酶生长受体HER—2/neu的研究中也得到证实。HER—2/neu受体过表达常出现在癌症患者中，它可通过p27Kipl降解而介导酪氨酸激酶的信号途径 ，从而刺激细胞增殖。HER—2/neu过表达和活化增强了p27Kipl降解，同时促进Jab1从细胞核向胞浆输出，促进p27Kipl降解［14］。此外Jab1在喉鳞状细胞癌表达时也发现，其表达与细胞恶性程度正相关［15］。本研究结果表明Jab1与肿瘤的转移有密切关系，同时也提示p27Kipl降解、酪氨酸激酶的信号途径启动与肿瘤的浸润和转移密切相关。
基因JWA（GenBank登录号AF070523），它是一种新型全反式维甲酸（ATRA）依赖的细胞骨架样基因，JWA可在ATRA、佛波酯TPA、Ara—C等诱导下，对人类骨髓白血病细胞分化起作用［16］。M3型白血病细胞在ATRA作用下的分化，可能启动JWA信号转导的通路。但在不同诱导剂处理后，其在不同的肿瘤细胞分化中表达不同，JWA参与细胞分化调控机制可能不同［17］。目前国内外尚未见到有关JWA与肺癌关系的报道，但从其调控机制及本研究芯片结果显示其表达在高转移人肺巨细胞癌细胞株中上调，提示它在肿瘤发生、转移过程中可能起重要作用。
在上调基因中，还有像（clon 33）S182（GenBank登录号HUMS182R）新基因，它所编码的蛋白可能含有复杂的跨膜区，与膜内在蛋白相似，其保守区域发生错义突变被认为是早发家族性阿尔茨海默病的原因［18］。目前也无此基因在肿瘤中作用的研究，但在本研究中，发现它在人高、低转移肺巨细胞癌细胞株中存在明显的表达差异，说明其与肿瘤转移能力可能有一定关系，这对今后此基因的功能进一步研究起到重要的提示作用。
总之，肿瘤的发生发展是多基因共同作用的结果，因而研究肿瘤转移的过程中也应该应用多基因分析。基因芯片技术高效、高通量分析细胞内的基因表达谱，为研究肿瘤转移相关基因提供了有效的工具，这为全面认识和更深入研究肿瘤转移机制、途径，提供了新的思路和线索。
本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
推荐访问： 基因 肺癌 筛选 用人 芯片
