[摘要] 目的：探讨牛磺酸对肾性高血压大鼠左室心肌细胞凋亡的影响。方法：75只大鼠随机分为3组，模型组、假手术组和给药组。其中模型组：采用二肾一夹(2KIC)法建立肾血管性高血压大鼠模型；给药组：高血压模型成功后，于术后4周末开始灌饲牛磺酸50 mg/(kg·d) 8周。采用末端脱氧核昔酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)进行心肌细胞凋亡原位检测；放射免疫法检测心肌AngⅡ含量；分光光度计法检测心肌细胞DNA含量。结果：进入结果分析的模型组、假手术组及用药组分别为17、30和8只。与假手术组相比，模型组术后第4、12周末心肌细胞凋亡均明显增多(P<0.01)；心肌细胞DNA含量和AngⅡ含量亦明显增多（P<0.01）。与4周末模型组相比，12周末模型组血压心肌细胞凋亡增多（P<0.05），心肌DNA含量明显增多（P<0.01），AngⅡ含量增多（P<0.01）。与12周末模型组相比，给药组心肌细胞凋亡减少（P<0.01），心肌DNA和AngⅡ含量明显减少（P<0.01）。结论：肾性高血压大鼠心肌细胞凋亡增多，牛磺酸治疗可抑制心肌细胞凋亡。
[关键词] 肾血管性高血压；牛磺酸；心肌细胞；细胞凋亡
[中图分类号]R331 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）09（a）-027-03
The effects of taurine on myocardial cells apoptosis in the rats with renovascular hypertension
GAO Ming-can1,2,YAN Xiao-hong1，LI Zhi-yi2
(1.Department of Physiology, Preclinical Medicine College，Wuhan University, Wuhan 430071,China; 2. Department of Physiology, Shangqiu Medical College, Shangqiu 476100,China)
[Abstract] Objective: To investigate the effects of taurine on myocardial cells apoptosis in the rats with renovascular hypertension. Methods: 75 Wistar rats were randomly divided into 3 teams, which were model team(MT), sham operation team(SOT) and medication administration team(MAT).Renovascular hypertension rat models were established by two-kindney one clip(2KIC) in MT. Since being renovascular hypertension for 4 weeks, rats had been fed with taurine for 8 weeks in MAT. Myocardial cells apoptosis was measured in situ with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling method. AngⅡ content in the left ventricle of the rats was detected by radioimmunoassay. DNA content was measured by spectrophotometry. Results: There were 17, 30 and 8 rats in MT, SOT and MAT respectively. The apoptotic index(AI) of myocardial cells of the rats in MT increased comparing with that in SOT at 4 and 12 week(P<0.01).At the same time both AngII content and DNA content elevated (P<0.01).In MT, the AI（P<0.01）, content of AngII （P<0.05）and DNA（P<0.01） of rats at 4 week were higher than those at 12 week. At 12 week, the AI, content of AngII and DNA of rats myocardial cells significant reduced in MAT, compared with those in MT (P<0.01). Conclusion: Myocardial cells apoptosis in renovascular hypertensive rats is stimulated which can be repressed by taurine.
[Key words] Renovascular hypertension; Taurine; Myocardial cells; Apoptosis;
细胞凋亡是活细胞的一种生理性死亡方式，是由一系列基因参与的主动程序性过程，它不诱发炎症反应，有别于细胞坏死[1]。研究显示[2]，细胞凋亡与许多心血管疾病的产生有关，例如高血压。Li等[3]研究显示，自发性高血压大鼠心衰组心肌细胞凋亡明显多于未心衰组和正常对照组，给予卡托普利治疗在改善心功能的同时，也抑制了心肌细胞的凋亡,表明心血管组织的细胞凋亡失调与高血压的病理形成有关。牛磺酸是机体内含量丰富的一种含硫氨基酸，近年研究证实[4]，高血压大鼠心血管组织中牛磺酸含量明显下降。应用牛磺酸治疗，可降低其高血压，逆转高血压心肌肥厚，降低循环缩血管物质(AngⅡ、ET)，升高舒血管物质(CGRP,牛磺酸)。本实验主要观察牛磺酸对肾性高血压大鼠心肌细胞凋亡的影响，探讨心肌细胞凋亡与循环缩血管物质的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
选健康雄性Wistar大鼠75只，体重180~220 g，年龄5~6周（河南省实验动物中心，合格证号：410220）。凋亡检测试剂盒德国B.M公司产品；牛磺酸武汉中健科技服务有限公司；AngII检测试剂盒北京北方免疫试剂研究所提供。
1.2 方法
1.2．1 建立高血压大鼠模型采用二肾一夹(2KIC)型肾血管性高血压模型[5],经3%戊巴比妥钠(30 mg/kg体质量，腹腔注射)麻醉，俯卧固定，沿左侧腰大肌外缘于背部作长约2~3 cm切口，游离左肾动脉，并用内径为0.25 mm的银夹缩窄。假手术组手术操作除左肾动脉不安置银夹外，其余同模型组。术后每天每只注射青霉素5万U防感染。术后4周始每周测血压一次，凡术后收缩压较术前升高20 mmHg以上，且高于135 mmHg者确定为高血压形成，并进行药物实验。
1.2.2 实验分组75只大鼠随机分为3组：①模型组(n=30)：制备肾血管性高血压模型，于术后4周末及12周末各麻醉处死15只。②假手术组(n=30)：手术操作除左肾动脉不安置银夹外，余同模型组，于术后4周末及12周末各麻醉处死15只。③给药组(n=15)：确定模型成功者，于术后4周末开始灌饲牛磺酸50 mg/(kg·d)8周，以5 m1/(kg·d)的容量给药，给药8周后麻醉处死。相应假手术组、模型组灌以同等容积生理盐水。
1.2.3心肌AngⅡ含量测定取定量左室心肌，称重后加入0.5 mol/L乙酸5 m1,煮沸15 min，冷却后冰上匀浆，离心(3 000 r/min,20 min)，取上清液置-30℃低温冰箱保存，AngⅡ含量测定采用放射免疫法，药盒购自北京北方免疫试剂研究所，按说明书操作，所有测量配副管。
1.2.4 心肌细胞凋亡检测采用TDT介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)对凋亡细胞进行原位检测，主要流程是:石蜡切片脱蜡，梯度酒精逐步水化，20 μg/L蛋白酶K 37℃消化15 min，3 g/lH2O2：水溶液灭活内源性过氧化物酶，磷酸缓冲液洗，加末端转移酶与荧光标记的核甘酸反应混合液(37℃, lh),磷酸缓冲液(PBS)洗;加过氧化酶标记的抗荧光抗体(37℃,30 min),磷酸缓冲液洗，DAB（3.3-diaminobenzidine，3.3-二氨基联苯胺）显色，苏木素核复染，脱水透明封片检测。阴性对照的反应混合液中不加末端转移酶，阳性对照用已知阳性片，以胞核着棕黄色为阳性，用计算计图像分析系统分析，每组随机取4、5张切片，每张切片随机取10个视野，至少计数1 000个细胞，以细胞阳性染色的平均光密度值(OD值)表示凋亡指数(apoptotic index, AI)。
1.2.5 左室心肌DNA含量的测定取定量左室心肌称重，其总DNA提取测定采用苯酚氯仿法[6]，DNA浓度测定应用分光光度计法。心室肌总DNA含量用DNA含量(μg)/心室肌重(mg)表示。
1.3 统计学分析
所有数据均以(x±s)表示，采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验动物数量分析
纳入模型组、假手术组和用药组的大鼠分别为30、30、15只。模型组术后4周末及12周末分别有6只和7只大鼠造模失败，用药组在手术后4周末有7只造模失败，进入结果分析的模型组、假手术组及用药组分别为17、30和8只。
2.2 牛磺酸对肾性高血压大鼠心肌AngⅡ含量的影响
从表1可见，4周、12周模型组心肌AngⅡ含量与相应假手术组相比均明显增多，增多幅度分别为124% (t=3.21， P<0.01)和157%(t=3.69， P<0.01)。12周模型组心肌AngⅡ含量比4周模型组增多(t=2.22，P<0.01)。12周末给药组心肌AngⅡ含量明显低于模型组(t=2.14,P<0.01)。
2.3 牛磺酸对心肌DNA含量和细胞凋亡的影响
由表2可见，4周、12周模型组心肌DNA含量与相应假手术组相比明显增多(t=2.81,P<0.01；12周t=30.1,P<0.01),12周模型组心肌DNA含量比4周模型组增多(t=2.91,P<0.01)。给药组心肌DNA含量明显低于12周模型组(t=2.74,P<0.01)。经图像分析系统检测，各组心肌凋亡阳性染色的平均光密度值(OD值)显示，4周模型组OD值为假手术组2.04倍(t=2.62,P<0.01)，12周模型组OD值为假手术组2.53倍(t=2.78,P<0.01)；12周模型组OD值比4周模型组OD值增大(t=2.41,P<0.05)；给药组OD值较之12周模型组明显下降(t=2.61,P<0.01)，而与正常组相近。
与4周假手术组比较：aP<0.01；与12周假手术组比较：b P <0.01；与12周模型组比较：c P<0.01,与4周模型组比较：d P<0.05，e P<0.01。
3 讨论
越来越多的实验证明，高血压心肌细胞凋亡增多。Hamet等[7]最先证实自发性小鼠心室肌细胞凋亡增多。此后，Liu等[8]研究发现，自发性高血压大鼠心室肌细胞凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡刺激基因Bax表达量的比值Bcl-2/Bax（凋亡敏感指数的倒数）下降，显示心肌细胞对凋亡敏感性增强。与上述研究结果相似，本实验在肾性高血压大鼠模型上也观察到：无论是肥厚不明显的4周模型组还是明显肥厚的12周模型组，其心肌细胞凋亡均增加；与4周模型组相比，12周模型组细胞凋亡增多，凋亡增加呈时间依赖性。
本研究显示心肌细胞凋亡出现在心肌肥厚形成之前（4周）及形成后（12周），且应用牛磺酸治疗后，其心肌细胞凋亡反而受到抑制，肥厚消退。Li等[3]研究提示，SHR在由心肌肥厚向心力衰竭转变时，其心肌细胞凋亡明显增多，而卡托普利在改善心功能的同时，也使心肌细胞凋亡减少，因而推测，心肌凋亡增多是心衰中心肌细胞丢失的原因。实验证实，心肌细胞凋亡至少参与了高血压心脏损害的发生。
本实验观察到牛磺酸明显抑制了高血压大鼠心肌细胞凋亡的增多，作用机制可能与牛磺酸的一般药理作用有关。已由试验证实牛磺酸对某些细胞如血管内皮细胞、肝细胞凋亡有抑制作用[9]，其机制与牛磺酸抑制活性氧自由基和NO活性，稳定细胞内钙离子有关。事实上，高血压大鼠心肌存在钙超载现象[10]，牛磺酸对心肌钙超载具有抑制作用[11]，因此，我们推测牛磺酸可能通过上述途径抑制心肌细胞凋亡。此外，Diez等[12]研究发现自发性高血压大鼠心室肌细胞凋亡增多是与心肌局部血管紧张素转换酶活性增高有关；Fortuno等[13]研究显示，AT1受体拮抗剂对自发性高血压大鼠心室肌细胞凋亡的抑制作用是不依赖于血液动力学改变的，AngⅡ与其受体相结合可能促进凋亡刺激基因Bax表达增加，进而增强心肌细胞对凋亡的敏感性，抗高血压药如血管紧张素转换酶抑制剂、AT1受体拮抗剂可以抑制高血压心肌细胞凋亡增多[12、13]，这些提示高血压心肌细胞凋亡增多还可能与心血管局部血管紧张素系统改变有关。本实验发现，牛磺酸可明显降低了心肌AngⅡ含量。因此，牛磺酸可能通过血管紧张素转换酶抑制剂、AT1受体拮抗剂作用相同的途径抑制肾性高血压大鼠心肌细胞凋亡[14,15]。
总之，本实验证实肾性高血压大鼠心肌细胞凋亡增多，牛磺酸治疗对心肌细胞凋亡具有抑制作用。心肌细胞凋亡增多至少与高血压性心脏损害发生有关，因而，本实验提示抗高血压药物的研究也应着重于对心血管组织细胞凋亡的调控。
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（收稿日期：2007-06-09）
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