【摘 要】目的：探讨白芍总苷对干燥综合征模型小鼠饮水量和唾液量及T细胞亚群的调节作用。方法：将60只BALb/C小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、白芍总苷低、中、高剂量组和醋酸泼尼松组，除空白组外，其余各组均建立干燥综合征模型，观察白芍总苷对干燥综合征模型饮水量和唾液量小鼠血液中的T细胞亚群的影响。结果：白芍总苷各组均能不同程度增加干燥综合征模型小鼠唾液流量，以中、高剂量组效果显著，与醋酸泼尼松组相当（P > 0.05）。白芍总苷各组及醋酸泼尼松组均能降低干燥综合征模型小鼠外周血CD4+T细胞及CD4+/CD8+T比值，以中、高剂量组及醋酸泼尼松组作用明显（P < 0.01）。结论：白芍总苷能够增加干燥综合征模型小鼠唾液流量，降低CD4+T细胞及CD4+/CD8+T比值。
【关键词】 干燥综合征；白芍总苷；饮水量；唾液量；T细胞亚群；小鼠
干燥综合征（sjögren"s syndrome，SS）是一种以外分泌腺高度淋巴细胞浸润为特征的自身免疫性疾病，最常见的症状是口眼干燥。SS在中医文献中无相似的病名记载，目前多数学者将其归属中医学“燥证”范畴，气阴两虚、津血亏虚等是本病的致病因素，虚、疲、毒相互交结是本病的病理关键。目前，尚无根治性药物及方法，多采取替代及对症治疗以减轻口眼干燥等症状。白芍总苷（TGP）是白芍的主要有效成分，具有抗炎、镇痛、多途径双向免疫调节等作用[1]。有研究表明，TGP能改善SS患者口眼干燥症状[2]，但其作用机制尚不清楚。本课题组对TGP进行了一系列实验研究，现总结报告如下。
1 实验材料
1.1 实验动物 选择鼠龄为8周的BALb/C近交系小鼠60只，SPF级，雌雄不限，体质量20 g左右，购于重庆医科大学实验动物中心，合格证号SCXK（渝）2006104。严格遵循“3R”原则，实验动物饲养室自然光线，温度控制在18～19 ℃，湿度控制在40%～70%，动物自由摄食、饮水。实验结束以引颈法处死。
1.2 主要药物及试剂 TGP，宁波立华制药有限公司生产，生产批号060301；醋酸泼尼松，天津药业生产，生产批号20060512；百白破疫苗，北京天坛生物制品股份有限公司生产，生产批号2006060402；弗氏完全佐剂，Sigma USA生产，生产批号019k8719-81-2； PBS缓冲液，博士德生物工程有限公司生产，生产批号AR0030；CD4、CD8试剂，晶美生物制药有限公司生产，生产批号FG260611。
2 方 法
2.1 分 组 将60只小鼠随机分成空白对照组、模型对照组、TGP高剂量组、TGP中剂量组、TGP低剂量组、醋酸泼尼松组，共6组，每组10只。
2.2 动物模型的建立[3] 对模型对照组，TGP高、中、低剂量组，醋酸泼尼松组小鼠分别进行造模：各取10只同种小鼠，于无菌条件下取颌下腺，匀浆后加PBS稀释到1 000 μg·mL-1，加入弗氏完全佐剂，调整浓度为500 μg·mL-1，以每只1 mL的总量于小鼠的尾根部多点注射免疫，同时于背部注射百白破疫苗0.5 mL。在造模后第5周处死模型对照组小鼠2只，通过病理形态学观察，模型小鼠颌下腺发现特征性淋巴细胞浸润、腺体萎缩等SS典型病理改变，表明造模成功。
2.3 药物剂量换算 TGP成人每日用量为1 200 mg，
参照人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值
表[4]，换算成小鼠用量180 mg·kg-1；醋酸泼尼松成人每日用量20 mg，换算成小鼠用量3.0 mg·kg-1，
一般以成人体质量为60 kg为基础计算。
2.4 给药方法 空白对照组正常饲养，不予任何药物；模型对照组予生理盐水灌胃；TGP高剂量组予TGP136 mg·d-1灌胃；TGP中剂量组予TGP 68 mg·d-1灌胃；TGP低剂量组予TGP 34 mg·d-1
灌胃；醋酸泼尼松组予醋酸泼尼松0.08 mg·d-1灌胃。
2.5 观察指标
2.5.1 小鼠饮水量的测定 每3天加水150 mL，3 d后称量水量，投入的水量分别减去剩余水量即为每3天每笼小鼠饮水量。
2.5.2 唾液量测定 灌胃2周后将无菌的脱脂棉球制成干重为5 mg的棉球，放入小鼠的后颊部，
5 min后取出，电子天平上称重。唾液分泌量（mg）=棉球湿重-棉球干重。
2.5.3 小鼠唾液腺T细胞亚群含量 小鼠眼眶取抗凝血2 mL，取20 μL CD4/CD8 FITC/PE标记抗体加入流式管底部，取100 μL EDTA抗凝的小鼠外周血加入5 mL流式管底部并轻轻振摇，使其与抗体充分混匀，室温避光孵育20～30 min，加入2 mL红细胞裂解液，混匀后避光放置10 min，溶解红细胞至液体透亮。将样品管以1 000 r·min-1离心5 min，充分倒去上清液，加入2 mL PBS洗液重悬细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液；
加入适量标记二抗，室温避光孵育20 min；加入2 mL
PBS洗液重悬细胞以1 000 r·min-1离心5 min，
弃上清液；加入0.5 mL PBS洗液重悬细胞，流式细胞仪检测。
2.6 统计学方法 采用SPSS 15.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用t检验，方差不齐用秩和检验，等级资料间比较采用秩和检验，计数资料用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 各组小鼠饮水量比较 各组小鼠饮水量在造模初期无差别，抗原注射后12 d小鼠饮水量显著增加，模型对照组小鼠饮水量逐渐上升直到实验结束，而TGP各剂量组和醋酸泼尼松组小鼠饮水量在一定程度上降低，并维持在一定水平。见表1。
3.2 各组小鼠唾液流量变化比较 造模2周后，与空白对照组比较，模型对照组小鼠唾液流量明显减少（P < 0.01）。各给药组与模型对照组比较，均能不同程度增加小鼠唾液流量（P < 0.01或P < 0.05）；以TGP中、高剂量组，醋酸泼尼松组作用较明显，TGP低剂量组作用较弱。见表2。
3.3 小鼠外周血中T淋巴细胞亚群检测 与空白对照组比较，模型对照组小鼠外周血CD4+T细胞、CD4+/CD8+明显升高，差异有统计学意义（P < 0.01）；
而CD8+T细胞平均含量虽降低，但差异无统计学意义（P > 0.05）。各给药组均能降低CD4+T细胞含量（P < 0.01或P < 0.05），以TGP中、高剂量组及醋酸泼尼松组的作用较明显，三组之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；TGP低剂量组与TGP高剂量组、醋酸泼尼松组比较，差异均有统计学意义（P< 0.01）。各给药组对CD8+T细胞含量影响不大，差异无统计学意义（P > 0.05）。各给药组均有降低CD4+/CD8+比值的趋势。醋酸泼尼松组、TGP中剂量组、TGP高剂量组能明显降低CD4+/CD8+比值，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），但与TGP低剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3 、图1。
4 讨 论
SS是一种以侵犯外分泌腺体为主的慢性自身免疫性疾病，临床表现以口眼干燥为特征，其病理表现主要为外分泌腺淋巴细胞及浆细胞局灶性浸润，淋巴细胞中又以CD4+T细胞为多，CD4+/CD8+T比例明显高于正常人，并与疾病严重程度有关，且B淋巴细胞的活性与T淋巴细胞缺陷有关[5]。人外周血T淋巴细胞根据细胞膜表面表达的受体分为三大不同亚群，临床通常检查CD3+、CD4+和 CD8+T 淋巴细胞亚群。CD4+T细胞又称辅助性 /诱导性T细胞（ T helper/ inducer，Th /Ti辅助细胞），主要功能是促进免疫细胞增殖、分化，协调细胞相互作用， 激发免疫应答。CD 8+T细胞又称抑制性/细胞毒性T细胞 （Tsuppressor /cy totox ic，Ts/Tc）抑制免疫应答。T淋巴细胞亚群可反映机体细胞免疫的基本状况，CD4+/CD8+被称为免疫调节指数，可在一定程度上反映机体的细胞免疫状态。
本实验研究显示，模型小鼠CD4+和CD4+/CD8+较正常小鼠明显升高，提示T淋巴细胞调节紊乱在SS的发生与发展中有重要作用，与众多研究结果具有一致性。对SS模型小鼠，予TGP灌胃后，均能不同程度地提高其唾液流量、减少其饮水量，尤以中剂量、高剂量效果明显，与醋酸泼尼松组相当。同时实验结果显示，各给药组均能降低SS模型小鼠外周血中CD4+T细胞及CD4+/CD8+T水平，以TGP中、高剂量组及醋酸泼尼松组作用明显，且TGP中、高剂量组对CD4+T细胞及CD4+/CD8+T比值的影响效果与醋酸泼尼松组相当。因此，我们推测TGP治疗SS的机制可能是通过抑制CD4+细胞活化，减少Th1/Th2细胞因子的产生，从而维持Th1/Th2平衡。
现代中医认为SS属中医学“燥证”范畴，其发病以气阴二虚为多，脾气虚和肝肾阴虚引起的津液生成和敷布异常是SS发病的关键。在SS的治疗方面，目前西医无有效的治疗办法，在急性期多采用激素治疗，长期服用副作用较大。中医主要采用滋阴润燥、健脾补血，结合清热解毒、活血化瘀、宣肺布津等方法，疗效颇佳。由于中医多是采用汤剂加减的方法治疗，效果虽好，但用药不便。白芍性凉，味苦酸，微寒，具有补血柔肝、滋阴润燥之功效，TGP是其主要有效成分，近年来对其药理作用的研究以及在风湿免疫病中的应用研究方面都取得了较大的进展[6]，研究者普遍认为TGP具有抗炎、镇痛、多途径双向免疫调节等作用。本研究显示，TGP对SS模型小鼠具有与激素相当的疗效，同时能改善其免疫学异常，可能替代激素在SS中的使用，从而避免其副作用，值得进一步深入研究。
5 参考文献
[1]李俊，粱君山，周爱武，等.白芍总甙对B淋巴细胞增殖和白介素1生成的调节作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1994，8（1）：53-54.
[2]鲁静，沈晖，刘永斌，等.白芍总苷治疗干燥综合征的临床观察[J].中国现代医学杂志，2006，16（1）：
78-80.
[3]肖林，杨军，暨兴华，等.干燥综合征动物模型的建立[J].重庆医学，2003，32（3）：306-308.
[4]吴端生，张建.现代实验动物学技术[M].北京：化学工业出版社，2007：283.
[5]唐福林.原发性干燥综合征的发病机制[J].中华风湿学病杂志，2000，4（1）：50-52.
[6]马丽，李作孝.白芍总苷的免疫调节功能及其临床应用[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（17）：244-246.
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