DOI： 10.3724/SP.J.1096.2011.01274
1（北京中医药大学药理教研室，北京 100029）2（首都师范大学化学系，北京 100037）
摘 要 通过左冠状动脉前降支放置Ameriod环制备冠心病慢性心肌缺血动物模型, 并结合冠脉造影等方法确立中医血瘀证证候，采用现代核磁共振（NMR）和模式识别技术, 分析冠心病心肌缺血血瘀证模型与假手术组小型猪4星期血清的共振氢谱，及相应代谢物谱群的变化, 开展中医血瘀证候学的研究。结果显示，该方法制备的模型4星期后确立为稳定的冠心病慢性心肌缺血血瘀证模型，PCA方法清晰地将模型组与假手术组动物分别，血清1HNMR谱的主成分分析（PCA）、两组动物代谢谱各不相同。假手术组与模型组比较发现, 血清中内源性代谢物柠檬酸、肌酸、γ-氨基丁酸、乳酸、肉碱、葡萄糖等含量上升，低密度脂蛋白（LDL）与极低密度脂蛋白（VLDL）等脂质代谢物的浓度下降。可见, 在血瘀证早期糖代谢与脂类代谢紊乱，两者互为因果，导致能量代谢中三羧酸循环（TCA）平衡的破坏，最终加重并恶化了冠心病血瘀证的进程，这些代谢物的特征组合模式可成为临床诊断与防治冠心病血瘀证的诊疗指标。
关键词 冠心病； 血瘀证； 核磁共振； 代谢组学
2010-10-20收稿；2010-12-23接受
本文系国家科技重大专项（No.2009ZX09502-018）、国家自然科学基金（No.30902020）资助
* E-mail: doctor_wangyong@sina.com
1 引 言
冠心病心肌缺血在世界范围内的发病率与死亡率高居首位［1］，目前主要依靠症状体征与心电图的改变、冠脉造影作诊断，花费大，不易开展，并且有创［2］。对其相关生物标记物研究尚缺乏特异性指标［3］。
代谢组学是对生物体内所有代谢物进行分析, 并寻找代谢物与生理病理变化相对关系的研究方法。相关技术的发展使筛查与诊断冠心病, 寻找其生物标记物成为可能［4］。目前，代谢组学检测技术包括核磁共振技术（Nuclear magnetic resonance, NMR）和基于质谱的技术。其中NMR具有不破坏样品的结构和性质、检测无偏向性等特点，更适用于生物样品的检测，具有良好的临床应用前景［5］。
对冠心病心肌缺血的研究多基于大鼠急性结扎所致的心梗或心衰模型，不符合临床慢性心肌缺血的发病过程。小型猪作为心肌缺血的动物模型，在心血管形态学、生理学方面与人类最为接近［6］，Ameroid 环吸收体液可均匀收缩致冠脉进行性狭窄，更符合冠心病慢性心肌缺血临床发展变化的全过程。本实验建立Ameriod环所致小型猪心肌缺血模型，通过冠脉造影评估冠心病缺血程度，并结合NMR对心肌缺血后血清代谢物变化情况进行分析，进一步寻找冠心病心肌缺血血瘀证可能的代谢标记物。
2 实验部分
2.1 材料与方法
2.1.1 冠心病心肌缺血血瘀证模型的建立与证候判别 在本课题组前期实验［7］的基础上建立了Ameriod 环所致小型猪心肌缺血模型。术后对动物采集包括舌象在内的四诊信息，并通过冠脉造影、血流变等辅助手段进行评价。根据1986年中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制订的血瘀证诊断标准对模型动物的证候进行判定, 确定在4星期时为稳定的冠心病心肌缺血血瘀证模型。
2.1.2 冠状动脉造影 穿刺右侧股动脉，透视下沿钢丝分别送入造影导管至左右冠脉口，行左冠状动脉造影。术后拔除导管及鞘管，穿刺点压迫止血15 min。第2和第4星期进行冠状动脉造影，观察冠脉狭窄及心肌缺血的程度。
2.1.3 代谢组学检测分析与统计学处理 在300 μL血清样品中加入200 μL 0.01%三甲基甲硅烷基丙酸{3-（trimethylsiyl）［2, 2, 3, 3-2H4］propionate, TSP}, 100 μL重水（D2O），定容，以14000 r/min 离心10 min，取上清550 μL进行检测。参考文献［5］，运用NMR技术对血清进行驰豫编辑实验（Carr-purcell-meiboom-gill, CPMG）和扩散编辑实验（Longitudinaleddy-delay, LED），分别观测血清中的小分子代谢物和大分子代谢产物。CPMG脉冲序列可以压制脂类等大分子的信号，得到氨基酸等小分子的代谢信息；LED脉冲序列则可以屏蔽氨基酸等小分子的信号，得到脂类等大分子代谢物的变化信息［8］。采用预饱和方式抑制水峰, 饱和时间为2 s, 混合时间为0.15 s, 谱宽7000 Hz, 采样点数32 k, 累加次数64次, 预饱和频率和中心频率都在水峰位置。自由感应衰减（Free induction decay, FID） 信号经过32 k傅立叶变换转为一维NMR谱图。以TSP化学位移定为0 ppm，对0.0～10.0 ppm区间内的谱图按每段0.01 ppm的宽度进行分段积分, 除去水峰区（δ 4.6～5.0）。将积分按每张谱的总积分强度归一化。所得积分数据采用Pareto标度化（Pareto scaling）进行预处理之后，输入到SIMCA-P+软件（v11.5, Umetrics, Ume, Sweden）进行主成分分析（Principal component analysis, PCA），以得分图和载荷图表示。
3 结果与讨论
3.1 冠脉造影结果
冠脉造影显示模型组在术后2星期时缩窄环狭窄程度已达到90%。4星期时，缩窄环狭窄程度达到99%，少数动物达到100%，表明冠心病心肌缺血模型已稳定的建立, 见图1（箭头处为左冠状动脉前降支）。
3.2 模型组手术4星期后血清的1HNMR谱及PCA分析
代谢组学研究中利用PCA方法可将原变量数据降维, 且能尽多地表征原变量的数据结构特征而不丢失信息［9］。本研究采用PCA方法对NMR谱图进行解析, 进一步研究了冠心病慢性心肌缺血状态下内源性代谢物的变化。模型组与假手术组PCA得分图与荷载图信息表明, 模型组与假手术组能沿t［2］轴清晰分开，且信息丢失少，CPMG与LED的PCA得分分别为62.59%和69.88%。血清整体成分稳定，大部分化合物聚集在特定区域，而其中对PCA分类贡献较大、差别明显的代谢物包括含量上升的葡萄糖（δ 5.23, 4.64）、乳酸（δ 4.2, 1.33）、柠檬酸（δ 2.67）、乙酸（δ 1.95）、γ氨基丁酸（δ 1.91）、肌酸（δ 2.93）、β羟丁酸（δ 1.20）、肉碱（δ 2.44）、亮氨酸（δ 0.9）、缬氨酸（δ 0.99）和含量下降的脂质体（VLDL and LDL，δ 1.27）、脂质体（Lipid＝CH－CH2, δ 2.06）。血清中代表性代谢物的NMR图谱、谱峰、化学位移及其信号强度变化列于图2和表1，PCA分析结果见图3。
表1 模型动物Ameriod环放置4星期后的血清代谢物
Table 1 Assessment of serum metabolites for model animals after operated for 4 weeks
3.3 代谢组学为病证结合冠心病血瘀证的诊断与治疗提供客观的依据
按照血瘀证诊断标准确立该模型术后4星期为稳定的冠心病心肌缺血血瘀证模型，进一步运用NMR技术对模型和假手术组动物进行血清代谢组学的比较分析。CPMG和LED得分图显示， 基于PCA技术的代谢组学方法能清晰地区分出模型组与假手术组，血清代谢组学可以较好地对中医血瘀证与非血瘀证进行辨识；两组差异谱峰对应的物质共同构成了心肌缺血血瘀证模型的代谢组学特征，其中血瘀证组表现为血糖升高、低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）的降低，血液粘稠度增高，与中医对血瘀证“稠、粘、凝、滞”的描述相符。可见，通过对证候相关代谢谱的研究，能够对中医证型进行相关规范化研究［10］。
冠状动脉前降支狭窄后，心肌缺血缺氧，导致三磷酸腺苷（Adenosine-triphosphate, ATP）急剧消耗，细胞质内的肌酸大大增加，激活了细胞内的糖分解过程，产生过量乳酸，释放入血液后，使得血乳酸的浓度大大升高，激活肝脏和骨骼肌细胞中的糖异生途径，将多余的乳酸转变成葡萄糖。此外，糖氧化供能障碍，使脂肪动员代偿性增强，作为脂肪酸分解氧化的关键物质，肉碱浓度迅速上升，脂肪酸的分解利用使VLDL和LDL合成原料减少，导致其含量下降，甘油三酯代谢障碍，从而为冠状动脉粥样硬化、脂质斑块的沉积提供了条件。作为糖与脂类代谢的最终通路，柠檬酸循环（Tricarboxylic acid cycle, TCA）出现异常［11］，表现为外周血清中柠檬酸与γ氨基丁酸含量的上升。可见，冠心病慢性心肌缺血状态下，糖、脂类代谢障碍，TCA通路的异常，是冠心病进行性恶化与转归的基础，其中柠檬酸、γ氨基丁酸、乳酸、肉碱等特定分子异常表达可能成为冠心病心肌缺血临床诊断与治疗的靶标，通过数据挖掘方法寻找它们之间特定组合模式可以用于诊断与临床疗效评价。
References
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Study of Mini-pig Serum of Coronary Heart Disease （Chronic Myocardial
Ischemia） with Syndrome of Blood Stasis Based on Nuclear
Magnetic Resonance Metabolomics
WANG Yong1, LI Zhong-Feng 2, CHEN Jian-Xin 1, CHUO Wen-Jing 1, LI Chun 1,
GUO Shu-Zhen 1, ZHAO Hui-Hui1, WANG Wei 1*, WANG Ying-Feng 2
1（Department of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029）
2（Capital Normal University,Beijing 100037）
Abstract To study coronary heart disease （chronic myocardial ischemia） with syndrome of blood stasis caused by Ameriod ring and its changes in the serum metabolite profiling, coronary angiography is used to evaluate the syndrome of the model, and nuclear magnetic resonance （NMR） and pattern recognition to analyze hydrogen resonance spectra of myocardial ischemia in coronary heart disease with syndrome of blood stasis after operated for 4 weeks. The results show that the principal component analysis （PCA） of serum NMR spectrum and metabolic spectrum in two groups are significantly different. Compared with the sham group, endogenous metabolites in the serum in model group have these changes: the levels of citric acid, creatinine, γ-aminobutyric acid, lactic acid, carnitine and glucose rise, and the concentration of lipid metabolites such as LDL and VLDL decline. Glucose metabolism and lipid metabolism disorders reinforce each other, which results a deterioration of coronary artery disease. These metabolites pattern may be used as clinical diagnosis and treatment of coronary artery disease indicators.
Keywords Coronary heart disease; Syndrome of Chinese Medicine; Nuclear magnetic resonance； Metabolomics
（Received 20 October 2010; accepted 23 December 2010）
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