乳铁蛋白酶标抗体的制备及其酶联免疫检测方法的建立

材料与方法

1.1 试验材料

从超市购买不同品牌、不同批次的婴幼儿配方奶粉10种，待测。

主要试验试剂有：牛乳铁蛋白标准品，纯度98%（日本进口分装）；酪蛋白、乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白（Sigma）；辣根过氧化物酶、吐温-20、甘油（Solarbio）；过碘酸钠、乙二醇、硼氢化钠、硫酸铵等（国内分析纯试剂）；磷酸缓冲液（PBS，pH值7.4，自制）、超纯水（自制）。

主要仪器有：移液枪、洗板机（Thermo）、酶标仪（美国 Bio-TEK）、37℃ 恒温培养箱（SANYO 公司）、低温离心机（HITACHI）、酶标板（Costar）。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞株2B12的复苏 将细胞株2B12从液氮中取出，迅速放入37～40℃的水浴中溶化1～2 min，然后1 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入完全培养液，转入细胞培养瓶，放入37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。待培养的细胞状态较好，细胞数量达到一定数值时，采用小鼠体内诱生腹水的方法进行单克隆抗体的制备。

1.2.2 细胞株2B12单克隆抗体的制备 采用辛酸-硫酸铵法纯化抗牛乳铁蛋白单克隆抗体2B12，并对纯化后抗体进行效价、纯度及蛋白浓度的测定。

1.2.3 辣根过氧化物酶标记单克隆抗体 采用过碘酸钠法[5-6]对单克隆抗体2B12进行辣根过氧化物酶标记，并对标记抗体进行活性测定。以包被缓冲液将牛乳铁蛋白抗原稀释后包被，包被浓度1 μg/mL，4℃过夜后用洗液将包被板条洗涤3次，然后將HRP-2B12以1︰200的比例开始进行倍比稀释，加入到酶标板孔中，100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗涤3次后加入显色液处理15 min，加入2 mol/L的H2SO4终止反应，读取酶标仪读数。通过酶标记物的OD280和OD403值，计算此次酶标记抗体的酶标记率。

1.2.4 多抗单抗夹心ELISA检测体系的建立 （1）HRP-2B12抗体最适工作浓度的确定。以包被缓冲液将纯化的抗牛乳铁蛋白多克隆抗体稀释为1.0 μg/mL，包被酶标板，4℃过夜；洗涤后用封闭液封闭1 h，洗涤后加入1 mg/mL牛乳铁蛋白标准品溶液，以PBS作为空白对照，37℃温浴45 min，洗涤后加入不同稀释倍数的2B12抗体溶液，37℃温浴30 min，洗涤后加入底物溶液，37℃显色15 min，终止反应；用酶标仪读出OD450值，空白孔值较低且阳性孔值在1.5以上所对应的浓度即为HRP-2B12抗体的最适工作浓度。（2）不同封闭剂的选择。抗牛乳铁蛋白多克隆抗体包被酶标板，4℃过夜，洗涤后，分为4组：第1组用1%OVA封闭；第2组用3%BSA封闭；第3组用10%小牛血清封闭；第4组未封闭；封闭液100 μL/孔，37℃下反应1 h。洗涤后，加入1 mg/mL的牛乳铁蛋白溶液，37℃温育30 min，洗涤，以PBS作为空白对照，加入最适浓度的HRP-2B12抗体溶液，每孔100 μL，37℃反应30 min，洗涤后加入底物溶液，37℃显色15 min，终止反应，用酶标仪读出OD450值，比较各组的OD450值和P/C值（P为阳性值，C为空白值），以选择合适的封闭液。（3）最适酶标抗体稀释液的选择。在上述试验最优的基础上，用不同的抗体稀释液将酶标抗体稀释至工作浓度，抗体稀释液分别为含有10%小牛血清、1%BSA和3%BSA的PBST溶液，然后进行双抗体夹心试验。比较各组的OD450值和P/C值，选择合适的抗体稀释液。（4）特异性测定。按照所建立的ELISA检测方法，对乳中其他主要蛋白如酪蛋白、乳白蛋白及β-乳球蛋白进行检测，同时以乳铁蛋白标准品为对照，蛋白浓度均为1 mg/mL，以确定所建立方法的特异性。

1.2.5 奶粉样品的实际检测 从超市购买了10种不同的婴幼儿配方奶粉，编号分别为1～10。奶粉样品处理方法：天平上称取1g奶粉样品，用5 mL 50～60℃左右温水冲开，离心机上3 000 r/min离心，除去上层脂肪，取100 μL奶样进行检测，以此确定奶粉样品中是否含有牛乳铁蛋白，检测结果与牛奶灌装标识进行比较，比较两者的符合率。

2 结果与分析

2.1 抗体的制备及纯化

复苏抗牛乳铁蛋白细胞株2B12，细胞株状态良好，经过扩大培养注射小鼠，制备约得30 mL腹水抗体。经过辛酸-硫酸铵法纯化测的腹水中蛋白浓度为8.03 mg/mL，采用凝胶成像测得蛋白纯度在80%以上。

2.2 酶标抗体特性测定

经过直接ELISA法测定，酶标抗体效价为1︰1.6×106，表明酶标抗体活性很高。其中在酶标抗体进行105稀释时，其OD450值约为1.0，因此将酶标抗体分别稀释104、105和2×105，以确定最适的工作浓度。计算得此次酶标记率为0.5。

2.3 HRP-2B12抗体最适工作浓度的选择

如表1所示，当多抗包被浓度为1.0 μg/mL， 将HRP-2B12抗体进行105倍稀释时，空白对照OD450值较低，P值在1.5以上较为合理，因此确定2B12抗体的稀释倍数为105倍。

2.4 不同封闭剂的选择

如表2所示，4种不同配方的封闭液中，以1%OVA封闭P/C值较大，与CK处理相差不大，封闭效果都比较好。因此，选择1%OVA作为试验的封闭液。

2.5 抗体稀释液的选择

如表3所示，3种不同的酶标抗体稀释液，以3%BSA的PBST溶液稀释酶标抗体，P/C值最大，因此选择该稀释液作为酶标抗体的稀释液。

2.6 特异性检测

选取牛乳中其他主要蛋白作为抗原，检测所建立方法的特异性，结果如图1所示。由图1可知，该方法检测酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白时，测定结果与空白对照的OD450值比值均<2.1，反应结果为阴性；检测乳铁蛋白标准品时测定结果与空白对照的OD450值比值≥2.1，反应结果为阳性。这表明该检测方法的特异性较好。

2.7 奶粉样品的检测

对奶粉样品进行了实际检测，结果如表4所示。10种奶粉样品中，6种含有牛乳铁蛋白的奶粉样品呈现明显的阳性结果，4种不含有牛乳铁蛋白的奶粉样品呈现阴性结果，此结果与奶粉灌装标识一致。

3 讨 论

该试验采用过碘酸钠法对抗牛乳铁蛋白抗体进行了辣根过氧化物酶标记，获得了活性很高的HRP-2B12，酶标记抗体效价达到了1.6×106。建立了二步法的双抗体夹心ELISA检测方法：确定HRP-2B12的使用浓度为稀释105倍，以1%OVA为封闭液、含3%BSA的PBST溶液为酶标抗体稀释液。以乳中其他主要蛋白如酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白对方法进行验证，结果显示该检测方法的特异性较好，只对牛乳铁蛋白产生阳性反应。采用该方法对市售婴幼儿配方奶粉中的牛乳铁蛋白进行检测，结果与灌装标识一致。与之前建立的检测方法相比，二步法双抗体夹心ELISA检测方法减少了试验操作步驟，缩短了检测时间。但是目前该方法只能定性测定，下一步将对方法的灵敏度、准确度和保存期等进行补充和完善，争取能够定量检测样品中的牛乳铁蛋白含量。

参考文献：

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（责任编辑：成 平）

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