感受态细胞进行诱导表达;以纯化的AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体，并以多克隆抗体为一抗，采用Western blotting检测AGO2蛋白在健康和带毒黑尾叶蝉中的表达情况。【结果】RT-PCR扩增获得的黑尾叶蝉AGO2基因片段为1635 bp，构建的pET-AGO2重组质粒能在BL21感受态细胞中成功表达出AGO2融合蛋白，其最适表达条件：温度28 ℃，IPTG浓度0.5 mmol/L，诱导时间5 h，摇床转速220 r/min。以纯化AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得的多克隆抗体效价为1∶106，抗体浓度约350 μg/mL。Western blotting检测结果表明，AGO2蛋白在健康和水稻矮缩病毒（RDV）感染黑尾叶蝉中均有表达，但与健康黑尾叶蝉相比，AGO2蛋白在RDV感染黑尾叶蝉中的表达水平更高，即RDV侵染能提高AGO2蛋白的表达水平。【结论】制备获得的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体具有高纯度和高效价，且特异性强，可用于检测AGO2蛋白在病毒感染黑尾叶蝉中的表达水平，进而揭示AGO2蛋白在介体昆虫RNAi途径中的功能机制。
关键词： 水稻矮缩病毒（RDV）;黑尾叶蝉;RNAi;AGO2蛋白;多克隆抗体;效价
0 引言
【研究意义】黑尾叶蝉（Nephotetlix cincticeps）是热带亚热带地区的主要水稻害虫之一，通过刺吸植物韧皮部而导致水稻枯萎及叶片褪绿（戴仁怀和倪琳，2011），除了影响水稻生长发育外，还通过持久增殖型方式传播水稻矮缩病毒（Rice dwarf vrirus，RDV）（Chen et al.，2011），但至今尚未研发出防治该虫害的特效药剂及有效策略。已有研究运用深度测序技术从水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）和水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）侵染的灰飞虱（Xu et al.，2012;Li et al.，2013）、南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）侵染的白背飞虱或灰飞虱（兰汉红等，2015;Lan et al.，2015，2016）及水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus，RGDV）侵染的电光叶蝉（Lan et al.，2016）中检测出大量病毒来源的siRNA（small interference RNA），并证实通过干扰Argonaute 2基因（AGO2）的表达能显著提高病毒在介体昆虫内的增殖水平，即AGO2蛋白组分在RNA干扰（RNA interference，RNAi）抗病毒免疫过程中发挥重要作用。因此，加强介体昆虫黑尾叶蝉RNAi免疫反应及其与水稻病毒互作方面的研究将有助于制定有效的防治措施。【前人研究进展】由small RNA介导的RNAi是生物体内保守且重要的抗病毒免疫反应。根据small RNA生成机制可将RNAi途径分为small interference RNA（siRNA）、microRNA（miRNA）和PIWI-interacting RNA（piRNA）3种通路类型（Karlikow et al.，2014）。在siRNA途径中，Dicer2（DCR2）识别并切割长的双链RNA（dsRNA）为21 nt siRNA，而siRNA与AGO2结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），最终沉默外源病毒等病原物基因的表达（Ding，2010）。在miRNA途径中，Dicer1（DCR1）切割单链RNA（ssRNA）形成的茎环结构双链区，生成的22 nt miRNA与Argonaute 1（AGO1）结合形成RISC，通过沉默内源基因表达而调节生物机体的生长发育过程（Lee et al.，2004）。piRNA途径发现于果蝇和小鼠等的生殖细胞中，在该途径中，非Dicer依赖生成的piRNA与Argonaute亚家族蛋白Piwi结合形成RISC，从而抑制转座子移动（Bronkhorst and van Rij，2014）。可见，siRNAs、miRNAs和piRNAs 3种small RNA均需与AGO蛋白结合形成RISC复合物后才能进行目标基因沉默，即AGO蛋白是RNAi的核心成分之一。AGO蛋白家族较大，且其功能较复杂。现已发现果蝇有5种AGO蛋白，秀麗隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）有27种AGO蛋白，人类有8种AGO蛋白，水稻有18种AGO蛋白，拟南芥（Arabidopsis thaliana）有10种AGO蛋白（Vaucheret，2008）。其中，果蝇的AGO2蛋白、拟南芥的AGO1和AGO7蛋白及栗疫病菌的AGO2蛋白功能缺失后，其抗病毒免疫活性丧失（van Rij et al.，2006;Qu et al.，2008），说明在昆虫、植物和真菌中AGO蛋白介导的沉默对于抗病毒免疫起关键作用。至今，在血吸虫（Schistosoma japonicum）、家蚕（Bombyx mori）、绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和水稻等物种中已有AGO蛋白抗体制备及检测应用的研究报道（杨燕萍等，2010;汪章勋等，2013;程小玲和杨加伟，2014;朱兵等，2018）。【本研究切入点】叶蝉和飞虱是引发水稻病害的主要介体昆虫，但由于缺乏针对叶蝉或飞虱AGO2蛋白的适当抗体，进而阻碍了介体昆虫AGO2蛋白在RNAi天然免疫途径中的功能及机制研究。【拟解决的关键问题】克隆黑尾叶蝉RNAi途径中的AGO2基因，经大肠杆菌BL21原核表达获得黑尾叶蝉AGO2融合蛋白并免疫新西兰大白兔以获得效价高且特异性强的多克隆抗体，为进一步研究AGO2蛋白在叶蝉RNAi免疫途径中的调控功能及作用机制提供技术支持。
推荐访问： 抗体 制备 克隆 蛋白 途径
