地衣芽孢杆菌LS-1产蛋白酶发酵条件的优化

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）LS-1，由本实验室分离、保藏。

1.1.2 主要试剂与仪器 试剂：酪蛋白、牛肉膏、琼脂粉等均为生物纯，北京奥博星;葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、 KH2PO4等均为分析纯，天津科密欧;酪氨酸，分析纯，sigma进口分装;Folin-酚试剂：上海国药。仪器：上海精宏DNP-9052电热恒温培养箱;上海智诚ZHWY-2102恒温培养振荡器;德国艾本德5430R高速台式冷冻离心机;上海跃进XMTD-204数显式恒温水浴锅;上海仪电雷磁PHS-3CpH计;上海舜宇恒平MP2002电子天平;申安LDZX-50KBS高压灭菌锅;奥林巴斯CX23双目光学显微镜;上海精科752N分光光度计。

1.1.3 培养基 种子培养基：酵母膏2.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，K2HPO4·7H2O 3.5g，KH2PO4 1.5g，NaCl 2.5g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。发酵培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶活力的测定[2]

1.2.1.1 酪氨酸标准曲线制作 配制10、20、30、40、50、60μg/mL的酪氨酸标准溶液，配制2%酪蛋白溶液;然后分别取上述溶液各1mL，各加0.55mol/L碳酸钠溶液5mL、Folin-酚试剂溶液1mL，振荡均匀，于40℃水浴中显色20min，取出用分光光度计于680nm，不含酪氨酸的反应体系为空白，分别测其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.1.2 待测酶液蛋白酶活力测定 将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中，预热5min;取1mL粗酶液加入2mL预热好的酪蛋白溶液中混匀后放入40℃水浴中保温10min后加入1mL10%TCA终止反应，取1mL上清液加入0.55mol/LNa2CO3 5mL，加入1mLFolin-酚试剂至40℃水浴显色20min后于680nm下测定吸光值，以加热灭活的酶液反应体系为空白。酶活力单位定义：40℃下，每分钟水解酪蛋白底物产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。计算公式：

蛋白酶活力（U/mL）=A×K×4÷10×n

式中：A：粗酶液平行实验的OD值;K：吸光常数;n：蛋白酶的液的稀释倍数;4：反应试剂的总体积;10：反应时间10min;所得结果表示至整数

1.2.2 发酵条件优化

1.2.2.1 单因素试验 选择培养基初始pH、接种量、培养温度、培养时间为影响蛋白酶活性的主要因素，通过单因素试验考察以上因素对LS-1产蛋白酶的影响。培养完成后，将发酵液在4℃，6000r离心10min取上清液测定酶活。（1）培養基初始pH：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，分别利用1.0M HCl溶液和1.0M NaOH溶液调整培养基pH为4.0～11.0，每个pH做3个平行，121℃灭菌30min后，将种子液按照4%的接种量分别接入三角瓶内，于摇床150r、37℃培养48h。（2）接种量：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min后，将种子液分别按照2%、4%、6%、8%、10%的接种量分别接入三角瓶内，每个接种量做3个平行，于摇床150r、37℃培养48h。（3）培养温度：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min后，将种子液按照4%的接种量分别接入三角瓶内，于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃5个温度摇床150r培养48h，每个温度做3个平行。（4）培养时间：将发酵培养基以50mL的装液量装入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min后，将种子液按照4%的接种量分别接入三角瓶内，于摇床150r、37℃分别培养12h、24h、48h、60h、72h，每个时间点做3个平行。

1.2.2.2 正交试验 根据单因素试验的结果，选取对LS-1产酶影响较大的因素设计正交实验。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线 详见图1。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 培养基初始pH对LS-1产酶的影响 由图2可知，LS-1在碱性环境中产酶能力较高，当培养基初始pH为11时，其酶活可达362.2U/mL。

2.2.2 接种量对LS-1产酶的影响 由图3可知，LS-1所产蛋白酶的酶活在接种量为2%～10%无显著性差异，说明接种量对产酶影响不大。

2.2.3 培养温度对LS-1产酶的影响 由图4可知，LS-1在40℃培养时，蛋白酶酶活最高，为242.9U/mL;当培养温度为50℃时酶活仍然较高，达238.2U/mL。说明LS-1在20～50℃时均能生长并产生蛋白酶，在40～50℃温度范围具有一定耐热性。当培养温度为60℃时酶活明显下降，可能是温度过高不适宜菌株生长或者是高温下蛋白酶活力丧失所致。

2.2.4 培养时间对LS-1产酶的影响 由图5可知，随着培养时间的延长，LS-1产蛋白酶活力逐渐上升，48h时酶活最高为276.7U/mL;而当培养时间达到60h后，蛋白酶活力略有下降，可能是菌株生长进入衰退期，产蛋白酶能力有所下降。

2.3 正交实验结果 根据单因素实验结果比较分析得出，接种量对LS-1产蛋白酶活力无显著影响，而培养时间、培养温度、初始pH的影响较大，故设计L9（33）的正交实验（见表1、表2）。由表2可知，对菌株LS-1产酶影响的主次顺序为B（培养温度）>A（培养时间）>C（初始pH），通过优化得到的产酶最佳条件是A2B2C3，即培养基初始pH为12，40℃下培养48h，LS-1酶活最高，为307.3U/mL。

3 讨论

中国浓香型白酒的生产采用固态发酵模式，在其发酵过程中存在丰富的微生物种群，其中分泌蛋白酶的微生物，能将物料中的蛋白质分解成小分子有机物质氨基酸，这些氨基酸会被微生物利用代谢，同时会提供丰富的前体物质促进白酒中香味物质的产生[3]。曾德勇[4]等在酱香型高温大曲中筛出了高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。马特[5]等在白酒窖泥中初筛出8株可产蛋白酶的菌株，复筛出3种高产蛋白酶的菌株分别为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。王俊英[6]等使用牛奶平板从酒曲中分离出6株有明显水解圈的产蛋白酶的菌株，其中直径比最大的为芽孢杆菌，最适产酶温度为40℃。

本实验中菌株LS-1从高温酒曲中分离，所产蛋白酶活力较高，在50℃生长仍然能够生长并分泌胞外蛋白酶，说明该菌株和其分泌蛋白酶均具有一定耐热性。下一步将对其酶学性质进行研究，为该酶在实际生产中的应用提供理论支持。

参考文献

[1]Banik R M，Prakash M.Laundry detergent compatibility of the alkaline protease from Bacillus cereus[J].Microbiol Res.，2004，159：135-140.

[2]张彩莹，肖连冬.生物化学实验[M].北京：化学工业出版社，2009：10-67.

[3]刘晓光，谢和，屈直.酱香型白酒风味物质的形成与微生物关系的研究现状与进展[J].贵州农业科学，2007，35（2）：131-134.

[4]曾德勇，方镒，刘涛，等.酱香型高温大曲中高产蛋白酶细菌的分离及鉴定[J].酿酒科技，2015（3）：27-30.

[5]马特，宋连宝，赵辉.白酒窖泥中蛋白酶产生菌的筛选及复配[J].食品科学，2016，37（7）：146-151.

[6]王俊英，侯小歌，张杰，等.酒曲中高蛋白酶产生菌筛选及酶学性质研究[J].中国酿造，2012，31（4）：33-36.

（责编：张宏民）

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