摘 要：探讨天然植物提取物牛至油对蔬菜致病真菌的抗菌作用及机制。采用中药抑菌实验方法测定了牛至油对番茄灰霉病菌和辣椒疫霉菌的抑菌活性和时期，并研究了在不同条件下牛至油的抗药性。结果表明，牛至油对上述2种真菌均具有明显的抑制作用，抑菌效果与浓度呈正相关，培养3天时的EC50分别为0.4076、0.4626 mg/mL；抑菌时期主要是在真菌的快速生长期，使其快速生长期滞后；抗性实验表明这2种病原菌菌株对牛至油都极为敏感。
关键词：牛至油；蔬菜；致病真菌；抑菌作用；抗药性
中图分类号：Q949.96 文献标志码：B 论文编号：2013-0946
Abstract： This paper explored the antibacterial effect and mechanism of natural plant extract oil on vegetable pathomycete. It not only measured the antibacterial activity and periods of oregano oil for Botrytis cinerea and Phytophthora capsici by using traditional Chinese medicine （TCM） bacteriostatic experiment method， but also studied the resistance of oregano oil under different conditions. It turned out that oregano oil have obvious inhibitory effect on the above two kinds of fungi， and the bacteriostatic effect and concentration were positively correlated， the developing 3 d EC50 were 0.4076， 0.4626 mg/mL separately， and the bacteriostatic period was mainly in fungal rapid growth period so that the rapid growth phase could lag. Resistance experiments showed that these two kinds of pathogenic bacteria strains were extremely sensitive to oregano oil.
Key words： Oregano Oil； Vegetables； Pathogenic Fungi； Bacteriostatic Action； Drug Resistance
0 引言
近年来，化学药物、化肥等化学物质大量使用，造成有害物质在植物体内、水中和土壤中聚集，一部分进入作物及人畜体内，严重地污染了环境并且影响人类的健康[1]。但是生物农药低毒、少残留、对环境影响较小，逐渐成为防治植虫物病害的创新点[2]。
当前植物提取物的研究在国内主要集中在大蒜、乌药、甘松、麻黄、黄柏、艾叶、苍术等植物上，2008年甘肃农业大学的王兴年等[3]发现苍耳提取物对番茄灰霉的孢子及菌丝均有着一定的抑菌作用。
植物精油是植物体内的次生代谢物质，化学组成较为复杂[4-5]。植物精油类物质大多具有杀菌、防腐等作用。早在1959年Ark等[6]就报道了大蒜的提取物对褐腐病菌有明显的抑制作用。赖毅东[7]研究表明，丁香、桂皮的乙醇提取物对这6种供试菌种的MIC均小于6.25 mg/mL。Soliman等[8]测试出百里香油、万寿菊油、留兰香油、罗勒油在较低的浓度下能完全抑制黄曲霉菌、寄生曲霉菌、赫曲霉菌和稻恶苗病菌的生长和真菌毒素的产生。Friendman等[9]用丁香油、月桂叶油等6种精油以及精油中一些成分如肉桂醛、紫苏醛、丁香酚、百里香酚、香荆芥酚对大肠杆菌，单核细胞增生利斯特氏菌、肠沙门氏菌有强烈抑制作用。宋义忠等[10-11]研究表明，丁香提取物对花椰菜和甜椒有一定的防腐保鲜作用，能够抑制采后花椰菜和甜椒褐变和失水，保持其品质。牛至油的研究很少，所以本研究旨在填补生物农药在牛至油上的空缺，通过测定了牛至油对番茄灰霉菌、辣椒疫霉菌的离体抑菌活性及抑菌时期，以及菌种对精油的抗药性，探索牛至油的抑菌机理，为开发生物活性高、不易产生抗药性、毒性小的生物农药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
研究田间试验于2012年在生物农药研究所进行，室内试验在毒理学实验室进行。
1.2 试验材料
牛至油（化工有限公司）、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉菌。戊二醛、磷酸缓冲液、丙酮、醋酸异戊酯、土豆、葡萄糖、琼脂。
LDZX-50FA立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、SW-CJ-2FD无菌操作台（苏州净化设备有限公司）、MJ-250-I霉菌培养箱（上海一恒科技有限公司）、YP1002N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 牛至油对2种植物致病真菌菌丝扩展的抑制效果 挑取适量的致病真菌菌丝于含药平板上，28℃培养，分别在第3天和第5天测量菌落直径，然后根据生长速率法[12]公式计算这2种菌菌丝扩展的抑制率，将所用到的浓度转换成对数值，通过Excel建立毒力回归方程，并计算这2种菌的有效中浓度（EC50） [13-14]。
1.3.2 牛至油对番茄灰霉和辣椒疫霉致病真菌生长期的影响 每100 mL培养基里面加25 mg牛至油，最终浓度为2.5 mg/mL，装平板，取蔬菜致病真菌菌饼（d=5 mm）反贴在培养皿的中间，以不加牛至油的培养皿作CK，28℃下培养，作3个平行对照，每隔一天测量菌落直径，然后取其平均值[15]。
1.3.3 2种植物致病菌在固体培养基上的抗性试验 用打孔器打取新鲜菌种的近边缘菌丝，接于牛至油的固体培养基上，25℃培养7天，取出量取菌落半径[16]。
2 结果与分析
2.1 牛至油对2种蔬菜致病真菌菌丝扩展的抑制效果
通过实验数据（表1）可得，牛至油在2.5～5 mg/mL范围区间内对番茄灰霉的抑菌效果比较好，但是在低于2.5 mg/mL时对辣椒疫霉的抑制效果更加明显，抑制效果与浓度成正相关。对辣椒疫霉菌，在菌丝生长至第2、3天时它们的EC50分别为0.4087、0.3976 mg/mL，线形回归方程分别是y=4.4948x+7.0012和y=3.5482x+6.3831；对番茄灰霉菌，在菌丝生长到第3、5天时的EC50分别是0.4536、0.4928 mg/mL，经计算可得其线形回归方程分别为y=5.0057x+6.6757，y=5.169x+6.5435，经检验，相关系数均达显著水平。
2.2 牛至油对番茄灰霉和辣椒疫霉2种菌生长期的影响
从图1～2可以看出，在牛至油作用下，2种菌在刚刚生长期都受到抑制，但从15 h开始，CK很快进入了生长期，伴随着菌落的直径迅速变大，番茄灰霉病菌到146 h已达到80 mm左右，处理组菌落在18 mm左右，对照组是处理后菌落直径的4.4倍，辣椒疫霉到75 h菌落直径已达到80 mm左右，处理后菌落直径在16 mm左右，CK菌落直径是加牛至油菌落直径的5倍。由此可得到，牛至油主要作用于番茄灰霉和辣椒疫霉这2种病原真菌的快速生长期，延长其生长期，使整个生长周期变短。
2.3 2种植物致病菌在固体培养基上的抗性试验
从表2可知，番茄灰霉和辣椒疫霉菌的致死浓度均在6 mg/L之内，表明这2种病原菌菌株对牛至油极为敏感。2种菌的抗性有所不同，辣椒疫霉对牛至油极其敏感，4 mg/L下可使其完全不长。
3 结论
采用平板稀释法研究了牛至油对辣椒疫霉和番茄灰霉2种菌的抑菌活性。实验结果表明，牛至油在不同稀释浓度下对番茄灰霉和辣椒疫霉菌丝扩展都有着一定的抑制效果，而且其效果与牛至油的浓度成正比。
对2种蔬菜致病真菌生长曲线的绘制，可以得出牛至油主要作用于番茄灰霉和辣椒疫霉菌的快速生长期，延长生长期，很大程度上是抑制了某些酶的活性，至于是哪些酶还有待于进一步研究。
通过含毒介质法测菌对牛至油的抗药性，表明这2种病原菌菌株对牛至油极为敏感，辣椒疫霉对牛至油极其敏感。
4 讨论
牛至油对蔬菜致病真菌有很好的抑菌效果，可开发成为植物源农药，但是牛至油的研究应用还很少，存在许多问题，如是否对人畜或者果蔬有害以及其抑菌机理的研究等，所以应该对药物进行毒理学试验和抑菌机理的一系列研究，确保其具有安全性，这样就更能有利于人类开发利用。
参考文献
[1]范小建，刘振伟，张玉香.中国农业统计资料[M].北京：中国农业出版社，2001：21-22.
[2]张智，李君明，宋燕，等.番茄灰霉病及其防治研究进展[J].内蒙古农业大学学报：自然科学版，2005，26（2）：125-128.
[3]吕佩珂，李明远.茄果类蔬菜病害[M].北京：中国农业出版社，2002：53-56.
[4]王宏年.几种植物精油抑菌作用研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2007.
[5]朱建兰.番茄灰霉病菌的生物学特性研究[J].甘肃农业大学学报，1995，30（1）：73-78.
[6]Ark P A， Thompson J P. Control of certain diseases of plants with antibioties from garlic（Allium sativum L.）[J]. Plant Disease Reporter，1959（43）：276-282.
[7]赖毅东.具有抑菌活性成分中草药的筛选及防腐保鲜应用机理研究[D].广州：华南理工大学，2003.
[8]Sano M. Effect of tea on lipid peroxidation in rat liver and kidney： a comparison of green and black tea feeding[J]. Biopharm Bull，1995，18（7）：1006-1008.
[9]Foel M， Lynch D V， Thompson J E. Membuane Deterioration in senescing carnation flowers[J]. Plant Physio1，1987，85：204-211.
[10]宋义忠，孔秋莲，孟宪军，等.丁香提取物对花椰菜保鲜效果的研究[J].上海蔬菜，2003（2）：40-41.
[11]孔秋莲，郑玉生，宋义忠，等.丁香提取物对甜椒保鲜效果的研究[J].上海蔬菜，2004（2）：65.
[12]Edwards S G， Seddon B. Mode of antagonism of Brevi bacillus brevis against Botrytis cinerea in vitro[J]. Journal of Applied Microbiology，2001，91：652-659.
[13]李保聚，朱国仁.番茄灰霉病发展症状诊断及综合防治[J].植物保护，1998，24（6）：18-20.
[14]王广要，周虎，曾晓峰.植物精油应用研究进展[J].食品科技，2006（5）：11-13.
[15]戴向荣.香肉桂油抑制黄曲霉作用研究[D].安徽：安徽农业大学，2007：25-16
[16]胡乐琴，潘迎捷.香菇对潮霉素的抗性实验[J].微生物学杂志，2003，23（4）：14-16.
推荐访问： 抑菌作用 抗性 真菌 致病 几种
