巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞增殖的影响

摘 要：如何能够促进软骨细胞的增殖是研究防治骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）的重大课题。采用体外培养兔软骨细胞的方法，在培养过程中加入巴戟天多糖；实验结果证实巴戟天多糖能够促进软骨细胞增殖，以125 μg/mL的浓度为最优，巴戟天多糖促进软骨细胞的增殖作用可能与其使细胞增殖核抗原（PCNA）的表达增加有关。

关键词：巴戟天多糖；体外培养；软骨细胞；增殖

中图分类号：G804.4文献标识码：A文章编号：1007-3612(2007)09-1216-03

骨性关节炎（osteoarthritis，OA），又称骨关节病，据统计，该病在中老年人群中发病率高达60%～80%，而该疾病的致残率可高达53%，被称为人类“下半生疾病"。 骨性关节炎（OA）的病因病机目前还不是很清楚，但最终都是由于软骨细胞的过度凋亡，进而导致软骨的破坏。在巴戟天的各种成分中以多糖的含量为最多，林励［1］等分析出5 a生巴戟天总糖含量在60％左右。本研究在前期工作的基础上拟通过对兔软骨细胞行体外培养研究其增殖及生长特性；通过观察巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞增殖的的影响，以探讨巴戟天多糖对兔软骨细胞增殖影响的生物学机制及其作用机理，进而阐述巴戟天强筋骨、祛风湿的机制，为新药开发提供理论依据。

1 实验材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 实验动物 3周龄大耳白兔（海淀区通利试验动物养殖场提供），皆为雄性。

1．1．2 主要试剂 高糖DMEM 培养基(Gibcol 公司)、胎牛血清（FCS, HyClone）、青－链霉素(华北制药股份有限公司)、胰蛋白酶（1：250, AMRESCO）、Ⅱ型胶原酶（Gibcol）、噻唑蓝（MTT, AMRESCO）、二甲基亚砜（DMSO，天津科密欧化学试剂开发中心）、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合体(SABC)免疫组化试剂盒（Boster公司）小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原PCNA单克隆抗体(中杉金桥公司)；兔抗小鼠IgG二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(中杉金桥公司)、巴戟天多糖（福建中医学院郭素华教授惠赠，纯度94.7％）。

1．1．3 主要儀器 AGl04电子分析天平(德国MTTLER-TCLEDO)；Φ690酸度计(德国BECKMAN)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；85-1l恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；LDZX-40H全自动压力灭菌消毒器（上海申安医疗器械厂）；TGL-16C水平离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；1 000 mL反复用过滤装置、手动真空泵(美国NalGene)；GBB16二氧化碳培养箱(德国Heraeus)；SW-CJ-2FD净化工作台(苏州安泰空气技术公司)；ZW-A微型振荡器(常州国华电器有限公司)；ELX808酶联免疫检测仪(美国BIO-TEK)；电冰箱(SIEMENS) ；IX70 倒置式系统相差显微镜(日本OLYMPUS) ； HU-12A透射电子显微镜（日本HITACHI）；P20、P200可调移液器（Eppendorf）；96孔培养板，250 mL密封旋盖斜颈细胞培养瓶；注射器针头滤器，0.22 μm滤膜（北京华美），流式细胞仪(Becton Dickinson FACScan,USA)等。

1．2 实验方法

1．2．1 软骨细胞的分离与培养 3周龄乳兔1只,体重200～225 g,皆为雄性。引颈致死,八四消毒液浸泡消毒10 min。无菌条件下从肱骨头、股骨远端和胫骨近端关节面切取软骨,剪碎成大小相对一致的颗粒(1mm3左右)。于平皿内用D-Hank"s液冲洗3次,将软骨颗粒移入50 mL消化小瓶内。加

投稿日期：2007-01-22

基金项目：国家自然科学基金课题。

作者简介：黄涛（1973－），男，辽宁人，博士，研究方向运动创伤学。入0.25%胰蛋白酶6 mL,于37℃恒温水浴振荡器内消化30 min。加入用DMEM配制的0.2% Ⅱ型胶原酶6 mL于消化小瓶内,于37℃恒温水浴振荡器内消化3次，每次60 min。将每次消化所得软骨细胞悬液稍作吹打, 收集于离心管中，经200目筛网过滤，离心(1000rpm)5 min后弃上清, 用DMEM洗涤两次,最后以软骨细胞培养基（高糖DMEM，含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10%FCS）配成软骨细胞悬液。软骨细胞按2.5×106细胞/瓶接种于培养瓶内,将培养瓶放置于孵箱内。培养条件为37℃、5%CO2浓度和饱和湿度。自接种后第3 d起隔日更换培养基。当细胞90％融和时用0.125％胰酶消化进行传代。实验使用2～3代细胞。

1．2．2 MTT比色试验测增殖 步骤：1） 接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层细胞。用含10%胎牛血清DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔5×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 uL。2） 培养细胞：将培养板移入CO2培养箱中，在37℃，5% CO2饱和湿度条件下，培养24 h。3） 加药：常规培养24 h后换成3%FCS的DMEM培养液100 uL/孔，同时加巴戟天多糖和维骨力，使多糖终浓度为10、5、2.5、1.25 ug/mL, 维骨力终浓度为143、47.6、15.9、5.4、1.8 mg/mL。4） 呈色：加药后分别继续培养24 h、48 h、72 h，弃去原培养基，每孔加入MTT溶液（1 g/L）100 uL，37℃继续孵育4 h后，小心吸弃孔内上清液，每孔加入100 uL DMSO, 振荡10 min,使结晶物充分溶解。5） 比色：选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各个孔光吸收值(OD值)，记录结果。

1．2．3 流式细胞仪检测增殖指数 步骤：1)将F2代软骨细胞0.125％胰蛋白酶消化后，接种于12孔板，常规培养24 h后换无血清的DMEM培养液24 h（饥饿细胞使细胞在同一水平增殖），然后使用正常软骨细胞培养基继续培养,同时各组分别加入2.5、1.25、0.625 μg/mL的巴戟天多糖和15 mg/mL维骨力。 2）每组设6复孔，培养24 h后，用PBS液清洗2次后，0125％胰蛋白酶消化，室温1 500 rpm离心，10 min，弃去上清液。PBS细1次，而后用70%冰乙醇固定。4℃保存，待测。3） 1 500 rpm离心10 min，弃上请，于室温下静置10 min，以使乙醇充分蒸发。加入PBS，调整细胞浓度为1×106/mL。4)每管加入100 uL A液（RNA酶），37℃水浴震荡30 min；每管加入400 uL B液（PI），4℃闭光30 min。5） 打开流式细胞仪，上机检测。6)应用CellQuest软件获取细胞，ModFit软件分析DNA数据，读取G1、S、G2期细胞数。

1．2．4 PCNA免疫组化染色实验 细胞按照2×104/mL接种于预先放置玻片的6孔板内，每孔接种3 mL。药物作用24 h后，弃去培养基，取出玻片，用免疫组织化学二步法检测PCNA表达情况。 步骤：1）PBS清洗标本1 min×3次。2）4%多聚甲醛固定1 h。3）PBS清洗５min×3次4） 1%Triton-x 100破膜，4℃过夜。5） PBS清洗５ min×3次。6） 3%H2O2室温孵育２０ min。7） PBS清洗５ min×3次。8） 一抗（小鼠抗PCNA单抗）孵育（滴度１∶４００）室温３ h。9） PBS清洗５ min×3次。10）二抗（兔抗小鼠IgG）孵育（滴度１∶１００）室温１ h。11）PBS清洗５ min×3次。12）ＤＡＢ显色６～８ min。

1．3 数据统计学处理方法 实验数据采用SPSS13.0统计软件包one-way ANOVA检验进行数据分析，实验数据以平均数±标准差表示，显著性水平为P＜0.05，非常显著性水平为P＜0.01；各指标间进行相关分析。

2 结 果

2．1 MTT比色实验结果 由表1可以看出，在第3 d时1.25 μg/mL的巴戟天多糖对兔软骨细胞的增殖与对照组有非常显著性差异；在第5 d时，5.0 μg/mL、2.5 μg/mL和1.25 μg/mL的巴戟天多糖对兔软骨细胞的增殖都有非常显著性差异，而以1.25 μg/mL为最佳。

2．2 流式细胞仪检测结果 由表2可以看出1.25 μg/mL的巴戟天多糖在第3 d时对兔软骨细胞的增殖作用，与对照组有显著性差异；而其它各组与对照组无显著性差异。

2．3 增殖核抗原（PCNA）检测结果 由图1和图2可以看出，图1中的棕黄色颗粒较图2中的棕黄色颗粒少，表明巴戟天促进体外培养兔软骨细胞的增殖作用与细胞核内PCNA的增加有关。

3 讨 论

3．1 巴戟天与巴戟天多糖 巴戟天是茜草科多年生攀援木质藤本植物，肉质根供药用，有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿的作用。巴戟天的化学成分较多主要有机成分包括：蒽醌类、多糖、氨基酸、脂类及有机酸类；无机成分主要是指微量元素，如Fe、Mn、Cu、zn、Cr、SM、Ni、Mo、C。、V、Sr等。在巴戟天的各种成分中以多糖的含量为最多，林励等分析出5 a生巴我天总糖含量在60％左右，总蒽醌含量为3％左右，水解氨基酸总量为1.2％～3.4％。因为多糖的含量在巴戟天中最多，因此巴戟天多糖的提取很关键，提取方法也有很多种。概括起来可分为酸提、弱碱提及蒸馏水提，研究证实蒸馏水提对多糖的破坏最小，为最优提取方法。本实验所用的巴戟天多糖由福建中医学院郭素华教授惠赠。经检测巴戟天多糖的含量（纯度）为94.6％，能够满足本实验的需要。

3．2 MTT比色法检测软骨细胞增殖的原理及巴戟天多糖对其的影响 噻唑蓝（MTT）比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法。活细胞，特别是在增殖的细胞中能量代谢旺盛，其中线粒体在能量代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的结晶沉积在细胞内和细胞周围，而死亡细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞的数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。其特点是灵敏度高，重复性好，操作简便，无放射性污染，与其它检测细胞活力的方法有良好的相关性［2］。本实验在预试验的基础上用MTT比色试验所筛选的巴戟天多糖不同浓度对体外培养兔软骨细胞的作用。结果显示巴戟天多糖能促进软骨细胞增殖，第3 d时巴戟天多糖1.25 μg/mL组与对照组有显著性差异（P<0.01）,其它各组与对照组相比无显著差异（P＞0.05）；第5 d时巴戟天多糖5.0 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL组与对照组相比有显著性差异（P<0.01）,且在1.25 μg/mL浓度时最佳。维骨力各浓度组对软骨细胞无明显地促进作用，与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。第3 d时各组与巴戟天多糖1.25 μg/mL组相比，对照组、巴戟天多糖10.0 μg/mL组有显著性差异；第5 d时，对照组、巴戟天多糖10.0 μg/mL组、维骨力5.3 mg/mL组与巴戟天多糖1.25 μg/mL组有显著性差异（P<0.01），其它各组无显著性差异（P＞0.05）。第3 d时，巴戟天多糖各浓度组与对照组相比增殖作用不是很明显的原因可能与软骨细胞的生长特点有关，第3 d时软骨细胞刚处于快速生长期的开始，因此此时加药所测的结果并不是非常好。第5 d时，软骨细胞正处于快速生长期，细胞代谢旺盛、生长活跃，因此此时加药所测定的结果较为理想，而我们的实验结果也正与此相一致。因此采用MTT比色实验测软骨细胞的增殖，时间选定在4～5 d时较为理想。无论何时间（3d还是5 d）、何浓度，维骨力15.9 mg/mL组与各浓度组巴戟天多糖相比，均无显著性差异，说明巴戟天多糖促进体外培养兔软骨细胞的增殖作用并不优于最适浓度的维骨力。

3．3 巴戟天多糖對兔软骨细胞增殖指数的影响 细胞中DNA含量与细胞周期密切相关，并随着细胞周期不同时期而发生变化。当细胞受到某些因素刺激时，可使DNA含量发生变化，从而引起细胞周期发生改变。流式细胞术测定细胞周期的基本原理是细胞经DNA荧光染色后，被分离的单个细胞逐个通过流式细胞仪的荧光探测装置，记录每个细胞的荧光强度。记录的荧光强度与DNA含量成正比，其中，G2期细胞和M期细胞的DNA含量为G1细胞的二倍，S期细胞的DNA含量则介于其间。从仪器上可以读出各期的细胞数。细胞增殖指数是S期与G2期DNA含量之和与S期、G2及G1期DNA含量和的比，它是反映细胞增殖的重要指标之一。本实验FCM结果显示，72h后巴戟天多糖不同浓度组细胞增殖指数（PI）以1.25 μg/mL浓度时最大，且与对照组相比有显著性差异（P<0.01），其它各浓度组及维骨力组无显著性差异。各组与1.25 μg/mL巴戟天多糖组相比，除15 mg/mL维骨力组外，均有显著性差异（P<0.05）。第5 d时与对照组相比，巴戟天多糖各浓度组及维骨力组均有显著性差异，以1.25 μg/mL巴戟天多糖组为最优；15 mg/mL维骨力组与1.25 μg/mL巴戟天多糖组无显著性差异（P＞0.05）。此结果与MTT比色实验的结果相一致，表明1.25 μg/mL浓度的巴戟天多糖为最适浓度，能够促进体外培养软骨细胞的增殖。

3．4 PCNA表达与软骨细胞增殖 增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen简称PCNA）由Miyachi等于1978年在SLE（系统性红斑狼疮）患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名，研究发现PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标［3-5］。PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，是以受细胞周期调控的方式被合成的。在DNA合成稍前被合成， PCNA是polδ的辅助蛋白，促进该酶的活性，增强酶的行进性，使前导链连续不断地合成。在有PCNA存在时，出现前导链和后滞链合成；而缺乏PCNA时只合成早期复制的中间产物和短的后滞链片段。因此它使DNA合成的受细胞周期调控。在细胞核内存在可溶性与不溶性两种PCNA，可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，其量在DNA合成过程中不发生明显变化，易被去污剂提取、甲醇破坏；不溶性PCNA较稳定，不易被去污剂洗脱、甲醇破坏，这种PCNA在G0～G1期细胞中无明显表达，G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标［6-8］。本实验免疫组化结果证实，巴戟天多糖以1.25 μg/mL浓度组时软骨细胞表达致密的棕褐色颗粒最多，2.5 μg/mL巴戟天多糖及15 mg/mL维骨力浓度组较多，对照组则最少，说明巴戟天多糖可通过促进PCNA表达来调控DNA复制。

4 小 结

1) 巴戟天多糖影响软骨细胞增殖与药物浓度有关。适当浓度巴戟天多糖能显著促进软骨细胞增殖，而高浓度则抑制软骨细胞增殖。浓度为1.25 μg/mL时达到促增殖作用的最大效应。2) 巴戟天多糖治疗骨性关节炎的机理之一可能是巴戟天多糖可以直接刺激软骨细胞的增殖，进而使软骨细胞的增殖核抗原（PCNA）的表达增加。3) 巴戟天多糖促进软骨细胞增殖的作用与最适浓度的维骨力相比无显著性差异，即巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞增殖作用的影响并不优于最适浓度的维骨力。

参考文献：

［1］ 林励.不同年龄巴戟天微量元素、氨基酸及糖含量测定［J］.广州中医学院学报，1992，9（3）：160－161.

［2］ 宋今丹.医学细胞分子生物学［M］.北京：人民卫生出版社，2003．

［3］ Ogata K, Kur ki P, Celis J E, et al. Monoclonal antibodies t o anuclear p rotein （PCNA/ Cyclin） associated wit h DNA replication ［J］. Ex p Cell Res,1987,168（2）:475-486.

［4］ Van Dierendonck J H, WI jsman J H, Keijzer R, etal.Cell-cycle-related staining patterns of antiproliferating cell nuclear antigen monoclonal antibodies. Comparison with BrdUrd labelling and Kr267 staining ［J］. Am J Pathol, 1991, 138（5）:1165-1172.

［5］ Bravo R, Frank R, Blundell P A, et al. Cylin/PCNA is the auxliary protein of DNA polymerase-δ［J］. Nature,1987,328（6）:515-519.

［6］ 魏永昆.增殖细胞核抗原与肿瘤研究进展［J］.国外医学肿瘤学分册，1996，23（增刊）：47-9.

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