巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞凋亡的影响

摘 要: 如何能够抑制软骨细胞的凋亡是研究防治骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)的重 大课题。本研究采用由全反式维甲酸(RA)诱导的软骨细胞凋亡模型,流式细胞术检测凋亡 软骨细胞凋亡率、应用RealtimePCR对凋亡相关基因bcl2、bax的表达等进行观察。实验 结 果证实巴戟天多糖的应用可以显著降低由于应用全反式维甲酸(RA)而引起的软骨细胞凋亡 率。巴戟天多糖抑制软骨细胞凋亡可能与凋亡抑制基因bcl2的表达增加,凋亡促进基因ba x的表达下降,从而使bcl2在与bax形成的同源二聚体中占据优势来阻止线粒体膜上的PT孔 道开放,达到抑制凋亡的目的。

关键词:巴戟天多糖;体外培养;软骨细胞;凋亡

中图分类号:G804.2 文献标识码:A 文章编 号:1007-3612(2010)08-0056-06

The Influence of Morida Officinalis How Polysaccharide on the Ap optosis of Rabbit Chondral Cell Incubated Exosomatically

HUANG Tao1, ZHANG Ganglin1, LI Nan2

(1.Beijing Sport University, Beijing 100084 China; 2.Fujian College of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, Fujian China)

Abstract: How to hold up the apoptosis of chondral cells is a key issue in preventing oste oarthritis (OA). This research adopts the method of the model of apoptosis of c hondral cells induced by RA, uses flow cytometer to detect the apoptosis rates o f chondral cells, and adopts RealtimePCR to conduct observations of the expres sions of the relevant factors such as bcl2 and bax. It proves that the applic ation of Morida officinalis How polysaccharide can remarkably reduce the rate ofapoptosis of chondral cells caused by the use of RA. Besides, Morida officinal is how polysaccharide can increase the expression of bcl2 but lower the expres sion of bax, thus opening the PT channel to check the process of apoptosis.

Key words: morida officinalis how polysaccharide; exosomatic incubation;cartilage cell; apoptosis

骨性关节炎(osteoarthritis,OA),又称骨关节病,据统计,该病在中老年人群中 发病率高达60%～80%,而该疾病的致残率可高达53%,被称为人类“下半生疾病”。 骨性关 节炎(OA)的病因病机目前还不是很清楚,但最终都是由于软骨细胞的过度凋亡,进而导致 软骨的破坏。因此在OA的预防和治疗上如何减少软骨细胞的过度凋亡,保持软骨细胞增殖与 凋亡的平衡成为关键所在。巴戟天(学名Morinda officinalis)始载于《神农本草经》, 具有补肾阳,强筋骨,祛风湿,益中气之功效。现代药理学研究证明巴戟天的化学成分较多 主要有机成分包括:蒽醌类、多糖、氨基酸、脂类及有机酸类。在巴戟天的各种成分中以多 糖的含量为最多,林励[1]等分析出5年生巴戟天总糖含量在60%左右。本实验所用 巴戟天多 糖是从巴戟天中提取出来的一种单体,经检测多糖的含量(纯度)为94.6%,能够满足体 外 培养细胞的实验需要。在我们前期的研究中分析巴戟天的醇提物和水提物可以促进体外培养 大鼠骨髓间质干细胞的增殖。因此本研究在前期工作的基础上拟通过对通过分析RA介导的凋 亡软骨细胞中bcl-2和baxmRNA的表达,探讨体外培养兔软骨细胞凋亡的机制,以期阐述巴戟 天多糖在体外培养兔软骨细胞凋亡中的干预作用,进而阐述巴戟天强筋骨、祛风湿的机制, 为新药开发提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 3周龄大耳白兔(海淀区通利试验动物养殖场 提供),皆为雄性。

1.1.2 主要试剂 高糖DMEM培养基、胎牛血清FBS(HyClone公 司);胰蛋白酶Trypsin1:250(Amersco);Annexin V-FITC试剂盒(Clontech公司); R A(ATRT,SIGMA);吖啶橙(AO,SIGMA);溴化乙淀(EB,SIGMA);二甲基亚砜(DMSO, 天津科密欧化学试剂开发中心);Rnase A(SIGMA);碘化丙啶(PI,天来生物制品公司) ;焦碳酸二乙酯(DEPC,上海博亚);bax、bcl-2、β-actin上下游引物(上海生工生物技 术有限公司)、Trizol Reagent(In 掺入复方法cdvfrcfvitrogen);TAKARA sybr PREMIXEX TAQ试剂盒(上海生工生物技术有限公司)、Tris碱(BioRad);溴酚蓝(华舜);甘 油(上海化学试剂公司);氯仿(上海化学试剂公司);异丙醇(上海试剂四厂)等;维骨力(爱尔兰罗达药厂,规格 0.25 g×2,批注文号:H20040637);巴戟天多糖(福建中医学院郭素华教授惠赠)。

1.1.3 主要器械 P2、P20、P100、P200可调移液器(Eppendor f)、25 cm2培养瓶、96孔细胞培养板(Nunc)、注射器针头滤器0.22 μm滤膜(φ25, 北京华美)、10 mL离心管、5 mL离心管、3 mL滴管、血球计数板、盖玻片等。

1.1.4 主要仪器 显微镜(OLYMPUS SMZ)、倒置相差荧光显微 镜(OLYMPUS IX70)、JEM -123U型透射电子显微镜(日本TEOL公司)、电冰箱(春兰)、SW-CJ-2FD净化工作台(苏州 安泰空气技术公司)、低速自动平衡离心机(LDZ5-2 北京)、GBB16二氧化碳培养箱(德国 Heraeus)、SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)、LDZX-40Ⅱ全自动压力灭 菌消毒器(上海申安医疗器械厂)、φ690酸度计(BECKMAN)、流式细胞仪(Becton Dicki nson FACScan,USA)、PE-9600型DNA扩增仪(PERKIO ELMER)、 AvantiTM30 型低温高速离 心机(BECKMAN)、DU-7紫外分光光度计(BECKMAN)、7000型荧光定量PCR仪(Applied Bio systems公司)、FD201稳压稳流电泳仪(上海医用分析仪器厂生产)、 DYC P-31C型电泳槽 (北京市六一仪器厂生产)、550型酶标仪(BIO-RAD)。

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